一种基于高分辨质谱成像技术原位可视化分析药用植物化学成分及空间分布的方法

1.本发明属于质谱成像技术领域，涉及一种用于药用植物化学成分鉴定及空间分布的质谱成像方法。


背景技术：

2.中医药作为中华文明和中华民族的瑰宝，不仅蕴含着中国优秀的传统文化，更为人们的健康保驾护航，越来越受到世界的关注。目前，多数中药的药效或毒性物质基础仍然不够清晰明确，对于其中化学成分的空间分布更是知之甚少。全面了解中药活性成分或毒性成分在药用植物中的空间分布能够更好地指导临床用药，具有重要意义。
3.质谱成像技术(mass spectrometry imaging，msi)是近年来发展迅速的一种原位质谱分析手段之一，具有灵敏度高、分析速度快、信息直观等优点。电喷雾解析电离成像技术(desorption electrospray ionization-mass spectrometry imaging，desi-msi)作为最主要的质谱成像技术之一，其最大的优点是不需要任何样品前处理技术，可直接进行上样，能有效避免样品前处理带来的损耗，既可以获得样本的全息质谱信息，又可以可视化分析目标物质的准确分布位置，为中药成分鉴定及空间分布的可视化分析提供了便利。
4.附子(radix aconiti lateralis preparata)是毛茛科(ranunculaceae)乌头属(aconitum l.)植物的子根，在我国主要分布于四川、云南、陕西、贵州的高山地区，尤以江油附子道地药材最为出名。附子含有丰富的活性成分，其分离分析一直受到人们的广泛关注。但由于附子成分复杂，且易受外界环境的影响，其活性成分的种类和含量在不同的生长阶段和不同的组织部位可能存在差异。虽然传统的分析方法如高效液相色谱法可以对样品进行准确的定性和定量分析，但天然药物特定药用部位中有效成分的含量分布并不直观，难以获得待测化合物的准确空间信息，其应用范围受到一定程度的限制。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于高分辨质谱成像技术原位可视化分析药用植物化学成分及空间分布的方法；本发明方法具有快速、简便、无需任何样品前处理技术等优势，能有效避免样品前处理带来的损耗，能对药用植物化学成分进行多级鉴定和可视化分析，为研究中药材化学成分物质基础及空间分布提供有力依据。
6.本发明提供了一种基于高分辨质谱成像技术原位可视化分析药用植物化学成分及空间分布的方法，包括如下步骤：
7.(1)将药用植物的待测样品切片，得到待测样本组织切片，将组织切片粘附于载玻片上并干燥，得到干燥的待测样本切片，于-80℃保存待测；
8.(2)将所述干燥的待测样本切片于光学显微镜下观察，得到待测样本切片的形态光学图像；
9.(3)采用质谱成像检测方法将所述待测样本切片在质谱仪中进行电离扫描，通过
数据处理软件对得到的质谱扫描数据进行处理获得待测样本切片中的全息化学成分的质谱成像图；
10.(4)对所述质谱成像图中信息，与标准品的质谱成像图或文献高分辨质谱数据进行比对，鉴定得到待测样本中的化学成分；
11.(5)通过对步骤(2)中所述待测样本切片的形态光学图像与步骤(3)中所述质谱成像图进行比对，得到待测样本中的化学成分的空间分布规律。
12.上述的质谱成像方法中，所述药用植物包括附子、鱼腥草和何首乌中的至少一种。
13.上述的质谱成像方法步骤(1)中，所述待测样品切片之前进行包埋和冷冻处理。
14.上述的质谱成像方法中，所述包埋和冷冻处理的步骤如下：所述待测样品用质量百分含量为0.5％～3％的羧甲基纤维素钠包埋后迅速置于液氮中进行冷冻。
15.上述的质谱成像方法中，所述切片采用冷冻切片机进行；
16.所述冷冻切片机的工作温度设置为-20～-50℃。
17.上述的质谱成像方法中，所述待测样本组织切片的厚度为20～50μm。
18.上述的质谱成像方法中，所述电离扫描的参数设置如下：
19.质谱仪型号为waters xevo g2-xs，系统为desi-msi；喷雾溶剂为95％甲醇，流速为3μl/min，喷雾电压为3kv，氮气雾化压力为0.4mpa。
20.上述的质谱成像方法中，所述电离扫描为依次进行的一级质谱扫描和二级质谱扫描，则所述质谱成像图包括一级质谱成像图和二级质谱成像图。
21.上述的质谱成像方法中，所述一级质谱扫描的参数如下：
22.模式选择正负离子扫描模式，质荷比可为100～1500，碰撞能量可为10ev，扫描直径可为100～600μm；
23.所述二级质谱扫描的参数如下：
24.模式选择正负离子扫描模式，质荷比可为50～1500，碰撞能量可为30～50ev，空间分辨率可为100～600μm。
25.本发明中，可根据药用植物所含化学成分的性质选择正负离子扫描模式。
26.上述的质谱成像方法中，所述数据处理软件包括hdi和masslynx；
27.采用所述数据处理软件进行处理方法操作均为本领域技术人员按照其方法即可实现对质谱扫描数据处理。
28.上述方法可用于对药用植物的真伪进行鉴定，并能确定药用植物各个部位化学成分的差别。
29.本发明具有以下有益效果：
30.本发明提供的质谱成像方法快速、简便、无需任何样品前处理技术，能有效避免样品前处理带来的损耗，能对其中的化学成分进行多级鉴定和可视化分析，为研究药用植物化学成分物质基础及空间分布提供一种全新的可视化分析方法。由实施例可知，本发明提供的质谱成像方法能够有效实现化学成分的鉴定及空间分布可视化分析，成像清晰直观。本发明方法可用于对药用植物的真伪进行鉴定，并能确定药用植物各个部位化学成分的差别。
附图说明
31.图1为中药质谱成像实验流程图。
32.图2为附子切片光学显微镜与质谱成像图。
33.图3为附子切片中主要化学成分质谱成像图。
34.图4为乌头碱标准品正离子模式二级质谱扫描图。
35.图5为附子切片中乌头碱正离子模式二级质谱成像图。
36.图6为9种代表性乌头生物碱的质谱成像图。
具体实施方式
37.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
38.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
39.本发明提供了一种基于高分辨质谱成像技术原位可视化分析药用植物化学成分及空间分布的方法，包括如下步骤：
40.(1)将药用植物的待测样品切片，得到待测样本组织切片，将组织切片粘附于载玻片上并干燥，得到干燥的待测样本切片，于-80℃保存待测；
41.(2)将所述干燥的待测样本切片于光学显微镜下观察，得到待测样本切片的形态光学图像；
42.(3)采用质谱成像检测方法将所述待测样本切片在质谱仪中进行电离扫描，通过数据处理软件对得到的质谱扫描数据进行处理获得待测样本切片中的全息化学成分的质谱成像图；
43.(4)对所述质谱成像图中信息，与标准品的质谱成像图或在线质谱数据库进行比对，鉴定得到待测样本中的化学成分；
44.(5)通过对步骤2)中所述待测样本切片的形态光学图像与步骤3)中所述质谱成像图进行比对，得到待测样本中的化学成分的空间分布规律。
45.在一个优选的实施例中，所述药用植物为附子。
46.在一个优选的实施例中，所述待测样品切片之前进行包埋和冷冻处理，步骤如下：所述待测样品用质量百分含量为1％的羧甲基纤维素钠(为本领域的常规方法)包埋后迅速置于液氮中进行冷冻。
47.在一个优选的实施例中，所述切片采用冷冻切片机进行；
48.所述冷冻切片机的工作温度设置为-25℃。
49.在一个优选的实施例中，所述待测样本组织切片的厚度为20μm。
50.在一个优选的实施例中，所述电离扫描的参数设置如下：
51.质谱仪型号为waters xevo g2-xs，系统为desi-msi；喷雾溶剂为95％甲醇，流速为3μl/min，喷雾电压为3kv，氮气雾化压力为0.4mpa。
52.在一个优选的实施例中，所述电离扫描为依次进行的一级质谱扫描和二级质谱扫描，则所述质谱成像图包括一级质谱成像图和二级质谱成像图。
53.在一个优选的实施例中，所述一级质谱扫描的参数如下：
54.可根据药用植物所含化学成分的性质模式选择正离子扫描模式，质荷比可为100～1500，碰撞能量可为10ev，扫描直径可为600μm；
55.所述二级质谱扫描的参数如下：
56.模式选择正离子扫描模式，质荷比可为50～1500，碰撞能量可为40ev，空间分辨率可为600μm。
57.在一个优选的实施例中，所述数据处理软件包括hdi和masslynx。
58.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种用于药用植物化学成分鉴定及空间分布的质谱成像方法进行详细地描述，但不是对本发明保护范围的限定。
59.实施例1、
60.附子中乌头类生物碱的成分鉴定及空间分布的质谱成像方法，按照如图1中流程，具体步骤如下：
61.(1)新鲜附子样品于2021年6月采集于四川省江油市附子种植基地。取新鲜附子部位，用质量百分含量为1％的羧甲基纤维素钠包埋置于液氮中迅速冷冻，冷冻完成后置于-80℃冰箱中保存备用；
62.(2)附子冷冻后使用冷冻切片机切片，冷冻切片机温度设置为-25℃，切片厚度为20μm，切片后将附子组织切片粘附在载玻片上，室温干燥5min，置于-80℃冰箱保存待测；
63.(3)将制备好的附子组织切片利用光学显微镜观察，获得完整清晰的附子横截面形态，如图2所示，为后期可视化分析附子中活性成分的空间分布提供基础；
64.(4)将制备好的附子组织切片采用质谱仪waters xevo g2-xs结合desi-msi系统进行扫描；喷雾溶剂为95％甲醇，流速为3μl/min。喷雾电压为3kv，氮气雾化压力为0.4mpa。采用正离子模式，一级质谱扫描的质荷比范围为100～1500，碰撞能量为10ev，空间分辨率为600μm；获得附子组织切片中的多种化学成分空间分布图像，如图3所示。
65.(5)为进一步鉴定获得的化学成分，对待测化合物进行二级质谱扫描，质荷比范围为50～1500，碰撞能量为40ev，空间分辨率为600μm。利用乌头类生物碱的标准品和文献中的高分辨质谱数据对目标化合物的一级和二级质谱信息进行比对，对待测物进行成分鉴定。如图4和图5所示，分别为乌头碱标准品的二级质谱信息和附子组织切片中质荷比为646.3299的化合物的二级质谱图，二级碎片能够很好地对应，因此确定该化合物为乌头碱。如图6所示，鉴定得到的9种代表性乌头生物碱的质谱成像图，由图6可知，附子中不同乌头生物碱有明显的空间分布差异，其中双酯型呈现出一种含量较多且较弥散的分布模式，主要分布于表皮和皮层，在中柱含量较低，单酯型高分布于表皮且含量相对于双酯型较少，无酯型高分布于维管柱。
66.以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于熟悉本领域的技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和发明构思，作出相应改变和替代，性能或用途相同，都应当视为本发明的保护范围。