一种β受体激动剂的快检试纸条及其制备方法和应用与流程

一种
β
受体激动剂的快检试纸条及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种定量鉴定技术领域，尤其是涉及一种β受体激动剂的快检试纸条及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]“瘦肉精”属于β受体激动剂，对人的危害很大，主要表现为在：急性中毒时出现心悸，面颈、四肢肌肉颤动，手指震颤，足有沉感甚至不能站立，头痛、头晕、恶心、呕吐、乏力，脸部潮红，皮肤过敏性紫色丘疹。
[0003]
目前食品中β受体激动剂检测的主要方法有：液质联用、质谱法、气质联用等仪器方法，仪器法虽然可以用于食品中瘦肉精含量的测定，但由于所使用的仪器设备体积过大，设备维护费用高、检测所需时间长，检测操作步骤繁琐，对于样本量大的的现场快速检测而言，这些方法就难以实现。
[0004]
免疫层析法因具有操作简便、结果清晰等优点，已成为临床快速诊断领域的热点。现有的瘦肉精试纸检测产品主要是在胶体金免疫层析技术的基础上制成的胶体金免疫层析试纸等系列产品，如专利文献cn203786122u公开了一种测量精度高的瘦肉精检测试纸卡，该试纸卡的金标物结合垫上包被有抗盐酸克伦特罗偶联物、抗莱克多巴胺偶联物和抗沙丁胺醇偶联物金标抗体的混合物，现有技术(陈艺宏.β受体激动剂金标检测卡的技术研究[d].福州大学,2017.)公开了β受体激动剂金标检测卡的制备条件及样品的前处理条件进行了优化,并披露了β受体激动剂金标检测卡所需抗原抗体的制备，现有技术(姜艳彬,孙冠如,王海,等.盐酸克伦特罗胶体金快速检测试纸条的研制[c],2011)公开以胶体金标记盐酸克伦特罗单克隆抗体竞争性膜层析技术制成了猪尿液中盐酸克伦特罗残留检测的快速检测试纸条。
[0005]
然而，目前胶体金免疫层析试纸条主要存在以下缺陷：1、胶体金显色单一，通常只能显示单一的红色，2、胶体金粒径不易控制，很难根据试纸的需要调整粒径的大小；3、胶体金标记过程中需要用到强还原剂，对人体健康有一定影响；4、胶体金表面没有生物活性基团，与抗体的结合完全靠静电作用，稳定性较差；5、胶体金粒径较h是圆形，粒径较大时为椭圆形，形状不稳定。
[0006]
综上所述，亟需开发一种成本低廉、操作简便、结果直观准确、灵敏度高、稳定性好的免疫层析检测方法。


技术实现要素：

[0007]
为了克服上述现有技术提到的问题，本发明目的在于提供一种β受体激动剂快检试纸条及其检测方法，本发明提供的试纸条成本低廉、操作简便、结果直观准确、灵敏度高、稳定性好。
[0008]
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
[0009]
本发明第一方面提供了一种β受体激动剂快检试纸条，包括样品垫、结合垫、nc膜、
吸水纸和胶板，其中，结合垫包括结合垫和彩色微球与β受体激动剂偶联物；
[0010]
所述结合垫由下步骤制备：
[0011]
a、浸泡：将结合垫置于结合垫浸泡液中浸泡，取出浸泡好的结合垫烘干；
[0012]
b、彩色微球活化：取彩色微球，超声，取超声好的彩色微球200μl加mes溶液混合均匀，离心、弃上清液，重复2次后再加入mes溶液混合均匀、超声；
[0013]
用上述mes溶液配制浓度5～20mol/l的nhs溶液，取nhs溶液加入超声好的彩色微球中，再用纯水配制edc，edc溶液的浓度为10～20mol/l，取edc溶液1～5μl加入到上述彩色微球中，用锡箔纸包裹避光摇床反应5～30min，为活化后的彩色微球；
[0014]
c、彩色微球和β受体激动剂抗体偶联物的制备：取1μg/μl的β受体激动剂抗体1～5μl加入活化后的彩色微球中混合均匀，避光摇床反应0.5～3h，加入5～15μl的0.05～3mol/l的乙醇胺溶液混合均匀，避光摇床反应后离心，弃上清夜，用300～1000μl的微球稀释液混合均匀，超声5min，避光摇床反应1h，离心,弃上清液，用100～300μl的微球稀释液混合均匀、超声，形成均匀的β受体激动剂抗体-彩色微球溶液，将溶液置于在2～8℃下保存；
[0015]
所述β受体激动剂抗体的可以取1μl、1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl、4μl、4.5μl或 5μl；
[0016]
d、喷金和烘干：取出步骤c制备的溶液，加入喷金稀释液稀释，稀释后用碳酸钾调节 ph为8～9.5，在步骤a制备的结合垫上进行喷金，将喷金后的结合垫37～48℃烘烤1～1.5h；
[0017]
优选的，所述结合垫37℃烘烤1.5h；
[0018]
优选的，所述步骤d中用碳酸钾调节ph为9；
[0019]
所述结合垫浸泡液为ph＝7～7.5的0.03～0.05mol/l的tris-hcl缓冲溶液，其中包含3～5％的海藻糖、0.3～0.5％bsa、0.05～0.1％吐温；
[0020]
优选的，所述结合垫浸泡液为ph＝7.4的0.05mol/l的tris-hcl缓冲溶液，其中包含5％的海藻糖、0.5％bsa、0.1％吐温；
[0021]
其中，所述β受体激动剂抗体为异丙喘宁抗体、氯丙那林抗体、西马特罗抗体、特布他林抗体、妥布特罗抗体、西布特罗抗体、沙丁胺醇抗体、齐帕特罗抗体、克伦特罗抗体、莱克多巴胺抗体、非诺特罗抗体、马布特罗抗体、溴代克伦特罗抗体、马贲特罗抗体、苯乙醇胺 a抗体、溴布特罗中的一种或多种；
[0022]
所述微球稀释液为：0.01～0.02mol/lpbs和0.5～1.2％bsa；
[0023]
优选的，所述微球稀释液为0.01mol/lpbs和1％bsa；
[0024]
优选的，所述β受体激动剂抗体-彩色微球溶液的中的β受体激动剂抗体浓度为1～5μl/ml；
[0025]
所述喷金使用的稀释液的组成为：0.02％硼酸，0.2％peg20000，0.02％防腐剂，10％海藻糖，0.25％吐温，1％bsa。
[0026]
所述喷金的量为6～9.9μl/cm，优选为6μl/cm。
[0027]
所述6μl/cm为每厘米喷金步骤d中所述的加入喷金液、用碳酸钾调节的溶液6μl。
[0028]
步骤b中，所述mes溶液的ph选自4～5，优选为4.5～5；
[0029]
本发明中，所述mes溶液ph影响微球与抗体的结合，当ph为4.5～5时，微球与抗体结合效果最佳。
[0030]
进一步的，所述β受体激动剂抗体量为2～5μl/ml；
[0031]
比如，所述β受体激动剂抗体量可以为2、3、4、5μl/ml；
[0032]
进一步的，所述彩色微球的粒径为100～300nm，
[0033]
比如，所述彩色微球的粒径可以为100、200、300nm，优选为300nm。
[0034]
进一步的，所述的样品垫为玻璃纤维材质、聚酯纤维膜；
[0035]
优选为玻璃纤维膜；
[0036]
所述玻璃纤维膜的厚度为0.2～0.6mm，优选为0.3～0.45mm；
[0037]
所述玻璃纤维膜的爬速5～70mm/60s；优选的，所述玻璃纤维膜的爬速10～50mm/60s；
[0038]
优选的，所述的结合垫材质为玻璃纤维，吸水量为450
±
50g/m2；
[0039]
所述的nc膜选自宽度为20～25mm，爬速为100～125s/4cm的nc膜；
[0040]
所述的吸水纸选自爬速40～180s/mm、厚度0.87～1.13mm的吸水纸；
[0041]
更优选的，所述样品垫的型号选自：dl42、rb45、rb65、cb06、sb06、rb37、kb50 或sb08，更优选为，样品垫的型号选自：cb06、sb06、rb37、kb50或sb08；
[0042]
所述的结合垫的型号选自vl98、vl78或sap-z70，所述的nc膜的型号选自25mmjj120 或20mmjj120，所述的吸水纸的型号选自ch37、sh27、ch27或sh37，所述的胶板的型号选自pvc、sm31-40、smnf31-40或sma31-40；
[0043]
特别优选的，所述的样品垫的型号为sb06，所述的结合垫的型号为sap-z70，所述的 nc膜的型号为25mmjj120，所述的吸水纸的型号为ch37，所述的胶板的型号为pvc。
[0044]
进一步的，所述nc膜上含有t线和c线，所述t线包含β受体激动剂抗原，所述c线为包含igg，β受体激动剂抗原为异丙喘宁、氯丙那林、西马特罗、特布他林、妥布特罗、西布特罗、沙丁胺醇、齐帕特罗、克伦特罗、莱克多巴胺、非诺特罗、马布特罗、溴代克伦特罗、马贲特罗、苯乙醇胺a、溴布特罗，优选的，所述β受体激动剂抗原为莱克多巴胺、沙丁胺醇或盐酸克伦特罗。
[0045]
本发明另一方面提供了一种上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0046]
s1、样品垫的处理：将样品垫置于样品垫浸泡液中浸泡5～30min后取出置于烘箱中 36～42℃下烘干1.5～2.2h备用；
[0047]
优选的，步骤s1中浸泡时间为10min；
[0048]
优选的，步骤s1中烘干的条件为烘干温度37度，烘干时间2h；
[0049]
s2、结合垫的处理：将结合垫置于结合垫浸泡液中浸泡1.5～2.2h，取出浸泡好的结合垫置于烘箱中在37下烘干2h备用；
[0050]
s3、nc膜的制备：将第一溶液由第一稀释液稀释，再将第二溶液由第二稀释液稀释，将稀释后的第一溶液作为t线划线，稀释后的第二溶液作为c线划线；
[0051]
s4、将样品垫、结合垫、nc膜、吸水纸依次贴合在pvc胶板上，贴合顺序为：先贴nc 膜、结合垫压着nc膜，样品垫压着结合垫，吸水纸压着nc膜，彼此之间叠加长度一般为 0.8～1.5mm左右，贴合完毕以后用切刀将其斩切为宽度为3.8～4.2mm每条的试纸条；
[0052]
优选的，所述第一溶液为包含β受体激动剂抗原和bsa的溶液；
[0053]
所述第一稀释液的组成为0.01～0.03mol/lpbs+0.03～0.05％tritonx-100；
[0054]
优选的，所述第一稀释液的组成为0.01mol/lpbs+0.03％tritonx-100；
[0055]
所述第二溶液为igg溶液；
[0056]
所述第二稀释液的组成为0.01～0.03mol/lpbs+1～5％甲醇+0.03～0.05％tritonx-100；
[0057]
优选的，所述第二稀释液的组成为0.01mol/lpbs+3％甲醇+0.03％tritonx-100；
[0058]
优选的，当第一溶液为莱克多巴胺和bsa溶液时，采用第一稀释液稀释成莱克多巴胺浓度为0.2～0.9mol/l的溶液；第二溶液用第二稀释液稀释成igg浓度为0.4～1.0mol/l的溶液；
[0059]
比如，采用第一稀释液稀释成莱克多巴胺浓度可以为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9mol/l的溶液，采用第二稀释液稀释成igg浓度可以为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/l；
[0060]
和/或，当第一溶液为沙丁胺醇和bsa溶液时，采用第一稀释液稀释成沙丁胺醇浓度为 0.02～0.08mol/l的溶液；第二溶液用第二稀释液稀释成浓度为0.4～0.8mol/l的igg溶液；
[0061]
比如，采用第一稀释液稀释成沙丁胺醇浓度为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07或0.08mol/l 的溶液，采用第二稀释液稀释成浓度为0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mol/l的igg溶液；
[0062]
和/或，当第一溶液为盐酸克伦特罗和bsa溶液时，采用第一稀释液稀释成盐酸克伦特罗浓度为0.2～0.7mol/l的溶液；第二溶液用第二稀释液稀释成igg浓度为0.4～0.6mol/l的溶液；
[0063]
比如，采用第一稀释液稀释成盐酸克伦特罗浓度为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol/l的溶液，采用第二稀释液稀释成浓度为0.4、0.5、0.6、0.7或0.8mol/l的igg溶液；
[0064]
更优选的，当第一溶液为莱克多巴胺和bsa溶液时，采用第一稀释液稀释成莱克多巴胺浓度为0.8mol/l的溶液；第二溶液用第二稀释液稀释成igg浓度为1.0mol/l的溶液；
[0065]
更优选的，当第一溶液为沙丁胺醇和bsa溶液时，采用第一稀释液稀释成沙丁胺醇浓度为0.05mol/l的溶液；第二溶液用第二稀释液稀释成igg浓度为0.8mol/l的溶液；
[0066]
更优选的，当第一溶液为盐酸克伦特罗和bsa溶液时，采用第一稀释液稀释成盐酸克伦特罗浓度为0.6mol/l的溶液；第二溶液用第二稀释液稀释成igg浓度为0.5mol/l的溶液；
[0067]
取稀释后的第一溶液和稀释后的第二溶液，在nc膜上以0.8～1.2μl/cm的速度进行划线，将划好线的nc膜放入烘箱36～42℃烘干12～20min，制得nc膜；
[0068]
优选的，将划好线的nc膜放入烘箱37℃烘干15min，制得nc膜。
[0069]
进一步的，所述的样品垫浸泡液的配方包含：25～35mmol/lpbs、0.3～0.5％sds、 0.8～1.2％bsa和0.3～0.8％pva；
[0070]
优选的，所述的样品垫浸泡液的配方包含：30mmol/lpbs、0.5％sds、1％bsa和0.5％pva。
[0071]
本发明另一方面还提供一种β受体激动剂的检测方法，具体步骤如下：
[0072]
(1)配制一系列的浓度梯度的β受体激动剂标准品溶液，各取80～120μl加到前述方法制备的试纸条上，跑板8～12min之后，观察比较t线的亮度减弱程度；
[0073]
(2)取含有β受体激动剂的样品适量，将其浸泡入裂解液，摇晃2～3次之后静置3～
8min，之后取80～120μl加到试纸条的样品垫上，待其跑板8～15min之后观察试纸条t线的变化以及阴阳性的判断。
[0074]
优选的，所述浓度梯度为：1～100ng/ml；
[0075]
所述比较t线的亮度减弱程度为：记录步骤(1)中t线的亮度对应的标准品浓度；
[0076]
所述观察试纸条t线的变化为：将步骤(2)中的t线的亮度与步骤(1)中标准品t线亮度作比较，得出样品中β受体激动剂的含量区间。
[0077]
本发明另一方面还提供一种前述方法在检测动物源性食品中的β受体激动剂中的应用。
[0078]
所述动物源性食品包括：全部可食用的动物组织以及蛋和奶；
[0079]
优选的，所述动物源性食品包括人工饲养的家畜家禽、水生动物的肉类、脏器及其制品。
[0080]
本发明的有益效果：
[0081]
本发明的试纸条具有体积小、质量轻、便于携带、分析速度快、操作步骤简单等优点，打破了传统检测方法的局限性，对样本量庞大的现场快速检测提供了有力的技术支持。同时也给市场监督管理人员对于现场排查和检测带来了极大的便利。
附图说明
[0082]
图1～6为喷金稀释液的筛选图；
[0083]
图7～12为碳酸钾量的筛选图；
[0084]
图13～18为β受体激动剂抗体量的筛选图
[0085]
图19～24为nc膜的筛选图；
[0086]
图25～30为抗原稀释液的筛选图；
[0087]
图31～36为结合垫浸泡和不浸泡烘干效果对比图；
[0088]
图37～42为样品垫浸泡与不浸泡效果对比图；
[0089]
图43～48为喷金量浓度筛选图；
[0090]
图49～54为t、c线浓度筛选图。
具体实施方式
[0091]
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
[0092]
本发明中，术语“％”是指质量体积比，单位为g/ml，比如1％为100ml溶液里面加入 1g溶质。
[0093]
本发明中，术语“β受体激动剂”是指兽药中的β受体激动剂，为苯乙醇胺类物质，按照苯环上取代基的不同，可分为苯胺型(如克伦特罗，clenbuterol)和苯酚型(如沙丁胺醇，salbutamol；莱克多巴胺，ractopamine)，而苯酚型β受体激动剂又分为苯二酚型(如特布他林，terbutaline)。该类化合物能够改变动物体内的代谢途径，具有明显的促生长、提高瘦肉率及减少脂肪的效果，一般包括克伦特罗,沙丁胺醇,莱克多巴胺,齐帕特罗,氯丙那林,特布他林,西马特罗,西布特罗,马布特罗,溴布特罗,班布特罗等。
[0094]
本发明中，术语“跑板”是指将待测样品滴加到试纸条上后的进行的分析过程，在
本技术中，样品滴加到试纸条上，利用了毛细作用，滴加在一端的样品慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，使t线显色，从而判断样品中是否含有目标物待其通过结束后能够根据显色的结果能够定性定量检测。
[0095]
本发明中，术语“pbs”是指pbs缓冲液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。由于na2hpo4和kh2po4有二级解离，缓冲的ph值范围很广，而nacl和kcl主要作用为增加盐离子浓度。如有需要pbs还可以补加1mmol/l cacl2和0.5mmol/l mgcl2，以提供二价阳离子。
[0096]
本发明中，术语“mes”是指2-吗啉乙磺酸，配制mes缓冲液时，要用naoh调ph到目标ph值(ph5.5-6.7)。mes易溶于水，呈无色透明状。
[0097]
本发明中，术语“edc”是指水体系碳二亚胺，主要用于活化羧基，使水体系中的羧基、氨基、羟基在室温甚至低温条件下能够发生偶联反应，所以经常用于在生物化学领域，经常用于氨基酸类反应，如多肽的合成。
[0098]
本发明中，术语“tris-hcl”中文别名：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；tris盐酸盐。tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。tris被用于不同ph条件下的蛋白质晶体生长。tris缓冲液的低离子强度特点可用于线虫(c.elegans)核纤层蛋白(lamin) 的中间纤维的形成。tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一，其在电泳缓冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳定电泳过程中的ph。此外，tris还是制备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。tris也被用作滴定标准物。作为蛋白缓冲液时，若后续工作需要质谱，则不适宜用tris，最好换成其他质谱仪可耐受的缓冲液。
[0099]
本发明中，术语“tritonx-100”是指聚乙二醇辛基苯基醚，结构式为c
14h22
o(c2h4o)n。为无色或几乎无色透明黏稠液体。能溶于水、甲苯、二甲苯和乙醇，不溶于石油醚。折光率1.4894 (25℃)，粘度24
×
10-3pa
·
s。可以用在生化研究中。
[0100]
本发明中，术语“bsa”是指牛血清白蛋白，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kda，等电点为4.7，可以被用作封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液。
[0101]
本发明中，术语“igg”是免疫球蛋白g(immunoglobulin g，igg)的缩写，是血清主要的抗体成分，约占血清ig的75％。
[0102]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0103]
实施例1～24
[0104]
1.1彩色微球的活化
[0105]
彩色微球粒径300nm。
[0106]
一、彩色微球1的活化步骤：取彩色微球超声5min，取超声好的彩色微球200μl加1ml 0.05mol/l mes(ph＝5.0)溶液混合均匀，离心13000r/min、20min、弃上清液，再加1ml 0.05mol/l mes(ph＝4.5)混合均匀超声5min，离心13000r/min、20min，弃上清液，加200μl1ml 0.05mol/l mes(ph＝4.5)溶液混合均匀、超声5min，用0.05mol/lmes溶液配制nhs10mol/l，取15μl 加入超声好的彩色微球中，再用纯水配制edc15mol/l取2μl加入到上
述彩色微球中，用锡箔纸包裹避光摇床反应15min；
[0107]
二、彩色微球2的活化步骤：取彩色微球超声5min，取超声好的彩色微球200μl加1ml 0.05mol/lmes(ph＝5.0)溶液混合均匀，离心13000r/min、20min、弃上清液，再加1ml 0.05mol/lmes(ph＝5.0)混合均匀超声5min，离心13000r/min、20min，弃上清液，加200μl1ml 0.05mol/lmes(ph＝5.0)硼酸溶液混合均匀、超声5min，用0.05mol/lmes溶液配制 nhs10mol/l，取15μl加入超声好的彩色微球中，再用纯水配制edc15mol/l取2μl加入到上述彩色微球中，用锡箔纸包裹避光摇床反应15min；
[0108]
三、彩色微球3的活化步骤：取彩色微球超声5min，取超声好的彩色微球200μl加1ml 0.05mol/lmes(ph＝5.0)溶液混合均匀，离心13000r/min、20min、弃上清液，再加1ml 0.05mol/lmes混合均匀超声5min，离心13000r/min、20min，弃上清液，加 200μl0.01mol/lph＝8.99硼酸溶液混合均匀、超声5min，用0.05mol/lmes溶液配制 nhs10mol/l，取15μl加入超声好的彩色微球中，再用纯水配制edc15mol/l取2μl加入到上述彩色微球中，用锡箔纸包裹避光摇床反应15min。
[0109]
1.2彩色微球与β受体激动剂抗体偶联物的制备：
[0110]
(1)彩色微球1与莱克多巴胺抗体偶联物的制备：取1μg/μl的莱克多巴胺抗体5μl加入活化后的彩色微球中混合均匀，避光摇床反应2h，加入10μl0.1mol/l的乙醇胺溶液混合均匀，避光摇床反应30min后离心13000r/min、10min，弃上清夜，用500μl微球稀释液 (0.01mol/lpbs+1％bsa)混合均匀，超声5min，避光摇床反应1h，离心13000r/min、10min, 弃上清液，用200μl的微球稀释液混合均匀(莱克多巴胺抗体量为4μl/ml)、超声5min. 在2～8度下保存；其中彩色微球1为紫色或黑色，莱克多巴胺抗体厂家为深圳市科捷实业发展有限公司。
[0111]
(2)彩色微球2与沙丁胺醇偶联物的制备：取1μg/μl的沙丁胺醇抗体5μl加入活化后的彩色微球中混合均匀，避光摇床反应2h，加入10μl0.1mol/l的乙醇胺溶液混合均匀，避光摇床反应30min后离心13000r/min、10min，弃上清夜，用500μl微球稀释液 (0.01mol/lpbs+1％bsa)混合均匀，超声5min，避光摇床反应1h，离心13000r/min、10min, 弃上清液，用200μl的微球稀释液混合均匀(沙丁胺醇抗体量为4μl/ml)、超声5min.在 2～8度下保存；其中彩色微球2为紫色或黑色，沙丁胺醇抗体厂家为安提生物。
[0112]
(3)彩色微球3与盐酸克伦特罗偶联物的制备：取1μg/μl的盐酸克伦特罗抗体5μl加入活化后的彩色微球中混合均匀，避光摇床反应2h，加入10μl0.1mol/l的乙醇胺溶液混合均匀，避光摇床反应30min后离心13000r/min、10min，弃上清夜，用500μl微球稀释液 (0.01mol/lpbs+1％bsa)混合均匀，超声5min，避光摇床反应1h，离心13000r/min、10min, 弃上清液，用200μl的微球稀释液混合均匀(盐酸克伦特罗抗体量为4μl/ml)、超声5min. 在2～8度下保存；其中彩色微球3为紫色或黑色，盐酸克伦特罗抗体厂家为西安齐岳生物。
[0113]
1.3样品垫的处理
[0114]
将样品垫置于样品垫浸泡液中浸泡10min后取出置于烘箱中37度下烘干2h备用，所述的样品垫浸泡液的配方为：30mmol/lpbs、0.5％sds、1％bsa和0.5％pva。
[0115]
1.4结合垫的处理：将结合垫置于结合垫浸泡液中浸泡2h，取出浸泡好的结合垫置于烘箱中在37下烘干2h备用，所的结合垫浸泡液为ph＝7.4的0.05mol/l的tris-hcl缓冲溶液，其中包含5％的海藻糖、0.5％bsa、0.1％吐温；
[0116]
1.5结合垫喷金步骤：
[0117]
取出莱克多巴胺抗体偶联物，超声5min，取超声好的微球抗体偶联物1μl加入100μl 的喷金稀释液(组分为：0.02％硼酸、0.2％peg20000、0.02％防腐剂、10％海藻糖、0.25％吐温和1％bsa)，稀释后用碳酸钾调节ph，配制成ph＝9的喷金混合液，其混合液中，碳酸钾的浓度为2μl/ml，将喷金混合液再次超声5min让微球抗体偶联物充分的混合均匀，喷金混合液抗体量为4μl/ml，并防止微球抗体偶联物的聚集，取出超声好的喷金混合液，采用 xyz三维喷金划线仪采用xyz三维喷金划线仪，以9.9μl/cm的速度在处理好的结合垫上进行喷金，将喷金后的结合垫置于烘箱中在37℃下烘干1h备用；
[0118]
取沙丁胺醇抗体偶联物，做法同前述莱克多巴胺抗体偶联物；
[0119]
取盐酸克伦特罗抗体偶联物，做法同前述莱克多巴胺抗体偶联物；
[0120]
所述的喷金稀释液配方：0.2％peg20000，0.02％防腐剂，10％海藻糖，0.25％吐温，1％bsa。
[0121]
1.6nc膜上t线和c线的处理
[0122]
分别取盐酸克伦特罗+bsa溶液和igg溶液，将莱克多巴胺+bsa溶液用0.01mol/lpbs +0.03％tritonx-100稀释，将igg溶液用0.01mol/lpbs+3％甲醇+0.03％tritonx-100的抗原稀释液进行稀释，稀释后溶液的浓度分别为0.8mol/l和1.0mol/l,然后用xyz三维喷金划线仪在nc膜上以1μl/cm的速度进行划线，将划好线的nc膜放入烘箱37度烘干15min备用；
[0123]
nc膜上t线和c线分别是沙丁胺醇+bsa溶液和igg溶液，将沙丁胺醇+bsa溶液用 0.01mol/lpbs+0.03％tritonx-100的稀释，将igg溶液用0.01mol/lpbs+3％甲醇 +0.03％tritonx-100的抗原稀释液进行稀释，稀释后溶液的浓度分别为0.05mol/l和0.8mol/l, 然后用xyz三维喷金划线仪在nc膜上以1μl/cm的速度进行划线，将划好线的nc膜放入烘箱37度烘干15min备用；
[0124]
nc膜上t线和c线分别是盐酸克伦特罗+bsa溶液和igg溶液，将盐酸克伦特罗+bsa 用0.01mol/lpbs+0.03％tritonx-100稀释，将igg溶液用0.01mol/lpbs+3％甲醇+0.03％tritonx-100的抗原稀释液进行稀释，稀释后溶液的浓度分别为0.6mol/l和0.5mol/l, 然后用xyz三维喷金划线仪在nc膜上以1μl/cm的速度进行划线，将划好线的nc膜放入烘箱37度烘干15min备用。
[0125]
1.7试纸条的组装
[0126]
将处理好的样品垫、结合垫、nc膜、吸水纸依次贴合在pvc胶板上，贴合顺序为：先贴nc膜、结合垫压着nc膜，样品垫压着结合垫，吸水纸压着nc膜。彼此之间叠加长度一般为1mm左右。贴合完毕以后用切刀将其斩切为宽度为4mm每条的试纸条。(在贴合的过程中习惯性的将nc膜上的t线靠近结合垫、c线靠近吸水纸)。
[0127]
其中，nc膜为25mmjj120。
[0128]
1.8试纸条的使用步骤
[0129]
以检测毛发中β受体激动剂β受体激动剂为例，使用本发明所制备的试纸条检测毛发中β受体激动剂(包括莱克多巴胺、沙丁胺醇或盐酸克伦特罗)，具体步骤如下
[0130]
(1)配制一系列的浓度梯度的β受体激动剂标准品溶液，各取100μl加到试纸条上，跑板10min之后，观察t、c线的亮度。浓度梯度为β受体激动剂浓度1、2、5、10、20、50， 100ng/
ml。
[0131]
(2)取含有β受体激动剂的样品1g适量，将其打碎加入1ml裂解液(乙醇/水体积比为1： 9)，摇晃2～3次之后静置5min，5min之后取100μl加到试纸条的样品垫上，待其跑板10min 之后观察试纸条t线的亮度，从而确定β受体激动剂含量的阴阳性判断。
[0132]
实施例2～24喷金稀释液配方优化
[0133]
β受体激动剂快检试纸条的制备方法同实施例1，区别仅在于步骤1.5中，喷金稀释液配方依次为：
[0134]
1号喷金稀释液组成：0.02％硼酸、0.2％peg20000、0.02％防腐剂；
[0135]
2号喷金稀释液组成：0.02％硼酸、0.2％peg20000、0.02％防腐剂和10％海藻糖；
[0136]
3号喷金稀释液组成：0.02％硼酸、0.2％peg20000、0.02％防腐剂、10％海藻糖和0.25％吐温；
[0137]
4号喷金稀释液组成：0.02％硼酸、0.2％peg20000、0.02％防腐剂、10％海藻糖和0.25％吐温，1％bsa。
[0138]
所述防腐剂为本领域所熟知的防腐剂。
[0139]
检测结果如图1～6所示，图中从上至下依次为1～4号喷金稀释液，莱克多巴胺组结果如图1、图4所示，沙丁胺醇组结果如图2、图5所示，盐酸克伦特罗组结果如图3、图6所示，图中从上至下依次为1～4号喷金稀释液，通过筛选发现，莱克多巴胺组、沙丁胺醇组、盐酸克伦特罗组的喷金稀释液均为4号喷金液时效果最佳。
[0140]
实施例25～61碳酸钾含量的优化
[0141]
β受体激动剂快检试纸条的制备方法同实施例1，区别仅在于，在步骤1.5结合垫喷金中，碳酸钾加入量的不同：图中从上至下依次为图7～12，用碳酸钾调节ph，配制成喷金混合液，其混合液中，碳酸钾的浓度为：(1)1.5μl/ml、(2)2μl/ml、(3)2.5μl/ml、(4)3μl/ml、 (5)3.5μl/ml、(6)4μl/ml。
[0142]
莱克多巴胺组如图7、图10所示从左到右碳酸钾的浓度依次为1.5μl/ml、2μl/ml、 2.5μl/ml、3μl/ml、3.5μl/ml、4μl/ml、对比可知2μl/ml的效果最好，其它搭配出现t 线或c线结合亮度不足的情况。
[0143]
沙丁胺醇组如图8、图11所示从左到右碳酸钾的浓度依次为1.5μl/ml、2μl/ml、 2.5μl/ml、3μl/ml、3.5μl/ml、4μl/ml、对比可知4μl/ml的效果最好，其它搭配出现t 线或c线结合亮度不足的情况。
[0144]
盐酸克伦特罗组如图9、图12所示从左到右碳酸钾的浓度依次为1.5μl/ml、2μl/ml、 2.5μl/ml、3μl/ml、3.5μl/ml、4μl/ml、对比可知2μl/ml的效果最好，其它搭配出现t 线或c线结合亮度不足的情况。
[0145]
实施例61～85抗体量的优化
[0146]
β受体激动剂快检试纸条的制备方法同实施例1，区别仅在于，在步骤1.2中，β受体激动剂抗体量分别为：(1)2μl/ml、(2)3μl/ml、(3)4μl/ml、(4)5μl/ml。
[0147]
莱克多巴胺组如图13、图16所示，从上到下加入的β受体激动剂抗体量依次为2μl/ml、 3μl/ml、4μl/ml、5μl/ml，效果对比可知4μl/ml的效果最好，其它的搭配均出现跑板效果不好的情况。
[0148]
沙丁胺醇组如图14、图17所示，从上到下加入的β受体激动剂抗体量依次为2μl/
ml、 3μl/ml、4μl/ml、5μl/ml，效果对比可知4μl/ml的效果最好，其它的搭配均出现跑板效果不好的情况。
[0149]
盐酸克伦特罗组如图15、图18所示，从上到下加入的β受体激动剂抗体量依次为2μl/ml、 3μl/ml、4μl/ml、5μl/ml，效果对比可知4μl/ml的效果最好，其它的搭配均出现跑板效果不好的情况。
[0150]
实施例85～96nc膜与结合垫的搭配优化
[0151]
β受体激动剂快检试纸条的制备方法同实施例1，区别仅在于，在步骤1.7中，与结合垫搭配的nc膜依次为：20mmjj120或25mmjj120。
[0152]
莱克多巴胺组结果如图19、图22所示，图中从上到下依次为25mmjj120、20mmjj120 号，由效果对比可知nc膜25mmjj120的效果最好。其它的搭配均出现释放不完全和跑板效果不好的情况。
[0153]
沙丁胺醇组结果如图20、图23所示，图中从上到下依次为25mmjj120、20mmjj120号，由效果对比可知nc膜25mmjj120的效果最好。其它的搭配均出现释放不完全和跑板效果不好的情况。
[0154]
盐酸克伦特罗组结果如图21、图24所示，图中从上到下依次为25mmjj120、20mmjj120 号，由效果对比可知nc膜25mmjj120的效果最好。其它的搭配均出现释放不完全和跑板效果不好的情况。
[0155]
实施例97-114抗原稀释液的优化
[0156]
β受体激动剂快检试纸条的制备方法同实施例1，区别仅在于，步骤1.6中稀释igg溶液的抗原稀释液：(1)pbs+15％蔗糖(2)pb+15％蔗糖(3)pbs+3％甲醇+0.03％tritonx-100，具体结果图25～30。
[0157]
莱克多巴胺组图中从左到右稀释igg溶液的抗原稀释液依次为pbs+15％蔗糖、pb+15％蔗糖、pbs+3％甲醇+0.03％tritonx-100跑板效果，不同抗原稀释液导致结合效果不同，由图 25、图28可知，pbs+3％甲醇+0.03％tritonx-100跑板效果最好。
[0158]
沙丁胺醇组图中从左到右稀释igg溶液的抗原稀释液依次为pbs+15％蔗糖、pb+15％蔗糖、pbs+3％甲醇+0.03％tritonx-100跑板效果，不同抗原稀释液导致结合效果不同，由图26、图29可知，pbs+15％蔗糖跑板效果最好。
[0159]
盐酸克伦特罗组图中从左到右稀释igg溶液的抗原稀释液依次为pbs+15％蔗糖、 pb+15％蔗糖、pbs+3％甲醇+0.03％tritonx-100跑板效果，不同抗原稀释液导致结合效果不同，由图27、图30可知，pbs+15％蔗糖跑板效果最好。
[0160]
实施例115～126结合垫的处理方式优化
[0161]
β受体激动剂快检试纸条的制备方法同实施例1，区别仅在于，步骤1.4中，结合垫的处理方式：(1)结合垫浸泡；(2)不浸泡。
[0162]
其浸泡液为ph＝7.4的0.05mol/l的tris-hcl缓冲溶液，其中包含5％的海藻糖、0.5％bsa、 0.1％吐温。
[0163]
莱克多巴胺组结果如图31、图34，图中从左到右依次为结合垫未浸泡和浸泡的跑板效果，结合垫不浸泡烘干之后会出现结合垫喷金液基本不释放，从而导致可与t、c线结合的抗体变少测定的灵敏度大大降低。
[0164]
沙丁胺醇组结果如图32、图35，图中从左到右依次为结合垫未浸泡和浸泡的跑板
效果，结合垫不浸泡烘干之后会出现结合垫喷金液基本不释放，从而导致可与t、c线结合的抗体变少测定的灵敏度大大降低。
[0165]
盐酸克伦特罗组结果如图33、图36，图中从左到右依次为结合垫未浸泡和浸泡的跑板效果，结合垫不浸泡烘干之后会出现结合垫喷金液基本不释放，从而导致可与t、c线结合的抗体变少测定的灵敏度大大降低。
[0166]
实施例127～138样品垫的处理方式优化
[0167]
β受体激动剂快检试纸条的制备方法同实施例1，区别仅在于，步骤1.3中，样品垫的处理方式：(1)样品垫浸泡；(2)不浸泡。
[0168]
莱克多巴胺组结果图37、图40，图中从上到下依次为结合垫浸泡和未浸泡的跑板效果，样品垫不浸泡烘干之后会出现t、c线结合的抗体变少测定的灵敏度大大降低。
[0169]
沙丁胺醇组结果图38、图41，图中从上到下依次为结合垫浸泡和未浸泡的跑板效果，样品垫不浸泡烘干之后会出现t、c线结合的抗体变少测定的灵敏度大大降低。
[0170]
盐酸克伦特罗组结果图39、图42，图中从上到下依次为结合垫浸泡和未浸泡的跑板效果，样品垫不浸泡烘干之后会出现t、c线结合的抗体变少测定的灵敏度大大降低。
[0171]
实施例139～150不同喷金量浓度的优化
[0172]
β受体激动剂快检试纸条的制备方法同实施例1，区别仅在于，步骤1.5中的喷金量不同：
[0173]
莱克多巴胺组结果如图43、图46所示，图中加入20ng/ml的标品后从左到右依次6μl/cm、 9.9μl/cm，通过对比效果可知6μl/cm效果较佳，浓度过高的喷金量会导致β受体激动剂含量测定不灵敏等问题。
[0174]
沙丁胺醇组结果图44、图47，图中加入20ng/ml的标品后从左到右依次6μl/cm、9.9 μl/cm，通过对比效果可知6μl/cm效果较佳，浓度过高的喷金量会导致β受体激动剂含量测定不灵敏等问题。
[0175]
盐酸克伦特罗组结果图45、图48，图中加入20ng/ml的标品后从左到右依次6μl/cm、 9.9μl/cm，通过对比效果可知6μl/cm效果较佳，浓度过高的喷金量会导致β受体激动剂含量测定不灵敏等问题。
[0176]
实施例151～180t、c线浓度的优化
[0177]
莱克多巴胺组与实施例1制备方法基本相同，不同点在于：从左到右t、c线浓度分别为：t线：0.2mol/l、c线：0.4mol/l；
[0178]
t线：0.4mol/l、c线：0.6mol/l；
[0179]
t线：0.5mol/l、c线：0.8mol/l；
[0180]
t线：0.8mol/l、c线：1.0mol/l；
[0181]
t线：0.2mol/l、c线：0.5mol/l。
[0182]
结果如图49、图52所示。
[0183]
沙丁胺醇组与实施例1制备方法基本相同，不同点在于：从左到右t、c线浓度分别为：
[0184]
t线：0.04mol/l、c线：0.4mol/l；
[0185]
t线：0.02mol/l、c线：0.6mol/l；
[0186]
t线：0.08mol/l、c线：0.7mol/l；
[0187]
t线：0.04mol/l、c线：0.7mol/l；
[0188]
t线：0.05mol/l、c线：0.8mol/l。
[0189]
结果如图50、图53所示。
[0190]
盐酸克伦特罗组与实施例1制备方法基本相同，不同点在于：从左到右t、c线浓度分别为：t线：0.4mol/l、c线：0.4mol/l；t线：0.5mol/l、c线：0.4mol/l；t线：0.6mol/l、 c线：0.4mol/l；t线：0.6mol/l、c线：0.5mol/l；t线：0.2mol/l、c线：0.4mol/l。结果如图51、图54所示。
[0191]
本发明的试纸条，在滴加β受体激动剂时t/c有明显的变化(即试纸条对β受体激动剂浓度有一定的灵敏度)，在空白跑板时t线的亮度比c线的亮，当测定β受体激动剂时待测样中的β受体激动剂抗原与结合垫上的抗体结合使得能与t线抗原结合的抗体量大大的降低了， t线的亮度明显减弱，从而实现试纸条对待测样中β受体激动剂浓度有较高的灵敏度。通过对测定值的比较和从经济效益的角度考虑莱克多巴胺的t、c线浓度分别为0.8mol/l、1.0mol/l，沙丁胺醇的t、c线浓度分别为0.05mol/l、0.8mol/l，盐酸克伦特罗t、c线浓度分别为 0.6mol/l、0.5mol/l为较优的实验方案，该浓度的设定既可以满足测定的灵敏度又能实现一定的经济效益。
[0192]
实验例1试纸条精密度测试
[0193]
采用实施例1所制备的试纸条，采用浓度1ng/ml的莱克多巴胺，取100μl加到试纸条上，跑板10min之后，肉眼观察跑板10min后的t线亮度，重复5次，具体结果见表1。
[0194]
表1 试纸条精密度测试结果
[0195][0196][0197]
由表1可知，莱克多巴胺的试纸条具有很高的精密性。
[0198]
采用实施例1所制备的试纸条，采用浓度1ng/ml的沙丁胺醇、浓度1ng/ml的盐酸克伦特罗浓度，取100μl加到试纸条上，跑板10min之后，肉眼观察跑板10min后的t线亮度，重复5次，具体结果见表2，表3。
[0199]
表2 试纸条精密度测试结果
[0200]
沙丁胺醇浓度(1ng/ml)t线亮度(紫色)t线亮度(黑色)1消失消失1消失消失1消失消失1消失消失
1消失消失
[0201]
由表2可知，沙丁胺醇的试纸条具有很高的精密性。
[0202]
表3 试纸条精密度测试结果
[0203][0204]
由表3可知，盐酸克伦特罗的试纸条具有很高的精密性。
[0205]
实验例2(试纸条特异性测定)
[0206]
采用实施例1所制备的试纸条，采用1ng/ml的磺胺类粉(四川睿标质检技术服务有限公司，规格是100ug/ml)、1ng/ml的黄曲霉毒素b1和1ng/ml的可卡因，以纯净水作为空白，各取100μl加到试纸条上，跑板10min之后，肉眼观察t线降低亮度程度，重复5次，具体结果见表4，表5。
[0207]
其余药品为市面上常见规格的黄曲霉毒素b1和可卡因。
[0208]
表4 试纸条特异性测定结果(紫色微球)
[0209][0210]
由表4可知，本发明的紫色试纸条具有很好的特异性，可以快速区分不同药类。
[0211]
表5 试纸条特异性测定结果(黑色微球)
[0212][0213]
由表5可知，本发明的黑色试纸条具有很好的特异性，可以快速区分不同药类。
[0214]
实验例3试纸条稳定性测试
[0215]
采用实施例1所制备的试纸条，采用浓度1ng/ml的β受体激动剂，取100μl加到试纸条上，采用不同的跑板时间之后，采肉眼观察t线降低亮度程度，重复5次，具体结果见表6，表7。
[0216]
所述β受体激动剂含有莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗。
[0217]
表6(紫色)试纸条稳定性测试结果
[0218][0219][0220]
由表6可知，本发明紫色微球试纸条稳定性很好。
[0221]
表7(黑色)试纸条稳定性测试结果
[0222][0223]
由表7可知，本发明黑色微球试纸条稳定性很好。
[0224]
实验例4实际样品检测
[0225]
取阳性样本适量，打碎后加入1ml裂解液，摇晃2～3次之后静置5min，5min之后取100μl 加到试纸条的样品垫上，待其跑板10min之后肉眼观察β受体激动剂含量阴阳性的判
断，具体结果见表8、表9。
[0226]
表8 试纸条(紫色)对样品肉类发中β受体激动剂含量的测定结果
[0227][0228][0229]
表9 试纸条(黑色)对样品肉类发中β受体激动剂含量的测定结果
[0230][0231][0232]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。