一种用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物及其应用

1.本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物及其应用。


背景技术：

2.目前，甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，过去的30年间，世界范围内其发生率均持续上升。目前，已有多种检测方法应用到甲状腺肿瘤的临床术前诊断中，包括颈部超声，ct，mri，pet及细针穿刺细胞学(fna)。其中fna敏感性最高，但仍有约25％的甲状腺结节病变单纯依靠fna无法排除恶性可能。病理组织学是临床诊断金标准，但在临床病理诊断中仍然有相当比例的甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性判定存在困难，尤其是甲状腺滤泡癌与甲状腺腺瘤病例的鉴别诊断，是甲状腺肿瘤病理诊断中最困难的部分。
3.甲状腺手术切除是治疗甲状腺肿瘤的主要手术方式，外科医生希望病理诊断特别是术中冰冻诊断可以给予临床及时有效的诊断信息，以指导临床手术方式及术后治疗。但甲状腺滤泡癌与甲状腺腺瘤病例的鉴别诊断，甲状腺乳头状癌与结节性甲状腺肿伴假乳头样增生病例的鉴别诊断，一直是病理诊断中的难点：“异型性”是病理形态学用于描述恶性肿瘤特征的名称，而在甲状腺滤泡癌中无论是结构上还是细胞学的异型性都不能作为诊断恶性的可靠指征，因为这些变化都可以见于甲状腺腺瘤；目前甲状腺滤泡癌可靠的病理学恶性诊断标准是出现明确的肿瘤细胞侵犯包膜及血管，但由于冰冻诊断过程中标本取材有限，无法对所有标本取材进行包膜和血管评估，因此术中冰冻判别甲状腺滤泡性病变良恶性非常困难；即使全面取材评估的石蜡标本，也有相当比例的病例虽然未观察到明确包膜或血管侵犯，但由于肿瘤具有明显的结构和细胞学异型性，病理医生也不能完全排除肿瘤恶性生物学的可能，无法给予临床有效的诊疗指导；有时转移到骨或肺的甲状腺滤泡癌，形态上可完全貌似甲状腺腺瘤，因此从形态上区别滤泡型腺瘤和滤泡癌有时是完全不可能的；造成诊断困难，大大增加了患者二次手术的可能性，增加了病人的痛苦。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
5.(1)目前甲状腺滤泡癌可靠的病理学恶性诊断方法中，由于冰冻诊断过程中标本取材有限，无法对所有标本取材进行包膜和血管评估，因此术中冰冻判别甲状腺滤泡性病变良恶性非常困难。
6.(2)若全面取材评估的石蜡标本，也有相当比例的病例虽然未观察到明确包膜或血管侵犯，但由于肿瘤具有明显的结构和细胞学异型性，病理医生也不能完全排除肿瘤恶性生物学的可能，无法给予临床有效的诊疗指导。
7.(3)当转移到骨或肺的甲状腺滤泡癌形态上可完全貌似甲状腺腺瘤，因此从形态上区别滤泡型腺瘤和滤泡癌有时是完全不可能的；造成诊断困难，大大增加了患者二次手术的可能性，增加了病人的痛苦。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物及其应用。
9.本发明是这样实现的，一种用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法，所述用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法包括：
10.对甲状腺滤泡性肿瘤标本进行质谱成像扫描；对所有样本完成质谱扫描后获得质谱数据，建立opls-da数学模型；利用分子标志物评估模型对恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤进行良恶性评估。
11.进一步，所述用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法包括以下步骤：
12.步骤一，收集病理科诊断的甲状腺滤泡性肿瘤标本并确定训练集和测试集；
13.步骤二，在训练集中获得甲状腺滤泡性肿瘤相关的差异代谢物分子标志物；
14.步骤三，对差异代谢物分子标志物进行结构鉴定，构建甲状腺滤泡性病变的良恶性评估模型，并在测试集中对评估模型进行验证；
15.步骤四，通过利用甲状腺滤泡性病变的良恶性评估模型，对恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤进行良恶性评估。
16.进一步，所述用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法还包括：
17.(1)临床肿瘤组织样本的收集、制片和扫描前处理
18.①
组织切片的制备与干燥：制作厚度1mm的切片贴于正电荷防脱载玻片表面；每个肿瘤组织共切片5张，其中4张用于正、负离子下质谱扫描，1张进行h&e染色，制片后放置于载玻片盒长期保存；
19.②
直至实验前取出切片置真空干燥器中，在室温真空干燥1h。
20.(2)肿瘤组织切片的h&e染色
21.①
苏木素染色2～3min，水洗5～10s；
22.②
1％盐酸酒精分化1～3s，水洗1min；
23.③
0.2％氨水反蓝3s，水洗1min；
24.④
1％伊红液染色2min，水洗10s；
25.⑤
脱水透明：80％乙醇稍洗1～2s、95％乙醇2～3s、95％乙醇3～5s、无水乙醇5～10min、石碳酸二甲苯5～10min、二甲苯2min、二甲苯2min、二甲苯2min；
26.⑥
中性树胶封固。
27.进一步，所述用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法还包括：
28.(1)确定质谱扫描切片实验的各项关键参数，建立成像方法学
29.①
使用afadesi-msi对gep-nens标本切片扫描，确定扫描过程涉及的关键参数；其中，所述关键参数包括：喷雾溶剂组成、样品移动速度、喷雾溶剂流速、离子注入时间以及不同质谱扫描范围比较；
30.②
通过阶梯式改变其中一项参数数值而维持其余参数不变，分析在参数设定下获得的质谱数据的强度值，确定最适合于gep-nens成像的质谱扫描各项参数；将数据转化及应用生物信息学进行统计分析，建立成像方法与实验路线。
31.(2)质谱成像数据的采集
32.①
将与载玻片长边平行的边长作为样品y轴移动的距离，计算y轴方向扫描一行所
需时间，所述时间是质谱数据文件的采集时间；
33.②
与载玻片短边平行的边长作为样品x轴移动的距离，计算每一个组织切片样本质谱扫描分析的行数和质谱数据文件数；
34.③
质谱成像数据的采集采用逐行扫描，在y轴方向以0.2mm/s的速度移动切片，相邻两个扫描行之间的步进间隔设定为0.2mm；在每一行扫描结束后，切片所在的载物平移台将以1mm/s的速度沿z轴方向下降2mm；以10mm/s的速度迅速返回到同一行的扫描起始点；沿x轴步进0.2mm后，z轴方向上升2mm；再开始下一行的扫描分析，循环往复直到完成所有样品区域的扫描分析；其中每一行的扫描数据单独保存为一个.wiff格式的数据文件。
35.进一步，所述用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法还包括质谱数据预处理及统计分析，具体包括：
36.①
数据导入与成像图重构：将质谱扫描获取的.raw格式的系列原始数据，利用xcalibur中的file converter功能全部转换成.cdf格式；在massimager的数据导入窗口输入切片的实际长与宽，一次性批量导入.cdf格式的原始数据生成导入序列，设置质谱峰检测斜率为100，最小峰强度为0，强度积分方式为总强度，质荷比计算方式为加权质荷比，获得覆盖全部质荷比范围100～1000的组织切片原位成像图；
37.②
可视化处理与成像图分析：从采集得到的afadesi-msi质谱轮廓图中选定表征整个组织轮廓的内源性代谢物，输入对应质荷比massimager的离子通道中，获得该离子在组织切片中的分布情况；任意选取出组织切片以外的背景区域，设定质荷比容差为0.005，扣除背景离子以得到更佳的成像效果；导入组织切片的h&e染色图，依次执行缩放、旋转以及位移操作，与代表性离子成像图叠加显示，从而选取感兴趣区域，并输出所述区域的平均质谱图；
38.③
通过成像软件对转移组和未转移组标本使用markerview软件进行数据合并；采用simca-p软件中的pca及opls-da模型识别方法进行多变量统计分析，对转移组和未转移组进行数据对照分析，确定与肿瘤转移相关的分子信息；
39.④
使用提取出的统计学意义的质荷比对各标本成像，评估各样本质谱成像图，发现各分子空间分布特点与规律。
40.进一步，所述用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法还包括各分子结构鉴定，具体包括：
41.①
gep-nens肿瘤组织约100mg，剪碎置于组织匀浆管中，加入4℃预冷的水400μl，再加入3粒陶瓷匀浆珠并拧上匀浆盖；
42.②
将匀浆管固定在组织匀浆机中，设定匀浆参数：频率30s/per time，速度4.0m/s，间隔时间30s，重复4次；
43.③
匀浆完成后，取匀浆液100μl置于1.5ml ep管中，加入400μl乙腈，涡旋2min，4℃离心5min，转速为10000rpm/min；
44.④
上清液转移至另一干净的1.5ml ep管中，置于真空离心浓缩仪中干燥，干燥时间约2h，取出后加入100μl复溶溶剂，离心过滤后进入色谱分析；
45.⑤
设定色谱条件进行线性梯度洗脱程序并进行质谱检测；
46.⑥
通过一级高分辨质谱获得代谢物的离子峰，推测可能的分子式；
47.⑦
做高分辨ms谱及ms/ms谱，结合原始质谱图对脂质分子及小分子代谢物进行结
构鉴定；同时结合高分辨质谱数据，参考相关文献和数据库lipid maps、massbank以及hmdb对内源性分子进行结构鉴定，确定具体类别。
48.进一步，所述用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法还包括关键分子相关的代谢通路，具体包括：
49.将所筛选和鉴定的差异脂质分子及代谢物分子进行异常代谢通路分析，利用metaboanalyst3.0的pathway analysis模块，将差异分子的标准名称输入并与kegg、hmdb以及pubchem数据库中化合物进行匹配；结合通路资源库进行检索，分别得到差异代谢通路图，并查找确定关键代谢酶。
50.本发明的另一目的在于提供一种实施所述的用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法筛选得到的用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物。包括脂肪酸合成酶及磷脂酸。
51.本发明的另一目的在于提供一种所述的用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物在制备用于甲状腺滤泡性病变良恶性鉴别诊断试剂盒中的应用。
52.本发明的另一目的在于提供一种所述的用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物在制备用于甲状腺恶性潜能未定肿瘤的评估剂盒中的应用。
53.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
54.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
55.质谱成像图像能够与组织学图像叠加对比具有非常大的优势，可以使获得的分子具有高度的组织特异性，与临床信息紧密相关；质谱成像技术就像是一张标准的数码照片，数字成像的色彩是通过红绿蓝3个颜色通道叠加而成的，屏幕上每个像素的颜色都是由这三种颜色的密度叠加而成，而想象一张拥有成千上万个颜色通道的图片，每个通道都是想要获取的分子的种类，这就是质谱成像。通过将这些不同的通道相互覆盖，便可以产生一个针对组织中分子构成和空间分布的彩色绘图，以最为直接明了的方式将组织中的信息展现在面前。质谱成像技术就像是免疫组织化学的高通量版本，但是没有抗体，使用质谱一次性就能挑选并绘制成百上千种分子的空间排列，研究者无需提前知道哪个分子，就可以高效率的使用质谱成像进行挑选，只需几个小时即可获得更为详尽的信息。更进一步的是，质谱成像通过对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行全面、快速分析的同时，可以对不同种类的病变组织进行对照研究，从而筛选出可用于诊断疾病的潜在生物标记，并对这些生物标志物在组织中的空间分布及在疾病发生发展过程的变化进行深入分析。
56.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
57.本发明通过基于质谱成像的代谢组学方法，确定了可用于鉴别诊断的关键代谢酶，为甲状腺滤泡性肿瘤的良恶性诊断或评估提供参考价值。
58.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在本发明的技术方案是否克服了技术偏见：
59.甲状腺肿瘤是内分泌系统最常见的肿瘤，病理组织学是临床诊断甲状腺肿瘤的金
标准，但在诊断甲状腺滤泡性腺瘤还是滤泡癌来说则非常困难。质谱成像技术(msi)是一种新型的分子影像方法，通过可视化的方式将组织中每一种分子的空间分布信息与相对丰度精确展示，具有无需特异性标记、分子特异性高、检测通量大等突出优势，为疾病生物标志物的原位筛查及免标记分子病理诊断提供了新型的诊断方法，因此本发明应用质谱成像方法帮助解决甲状腺肿瘤疑难病例的诊断，提供新的诊断方法和技术，为解决临床疑难病例提供新的可能。
附图说明
60.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
61.图1是本发明实施例提供的用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法流程图；
62.图2是本发明实施例提供的甲状腺滤泡癌及甲状腺滤泡性腺瘤的代谢物分子标志物的筛选示意图；
63.图3是本发明实施例提供的代谢物分子标志物用于甲状腺滤泡性病变良恶性鉴别诊断的结果示意图；
64.图4是本发明实施例提供的评估模型预测本例恶性风险低，评估结果为甲状腺腺瘤的示意图；
65.图5是本发明实施例提供的评估模型预测本例恶性风险高，评估结果为甲状腺滤泡癌的示意图；
66.图6是本发明实施例提供的评估模型预测本例恶性风险高，评估结果为甲状腺滤泡癌的示意图；
67.图7是本发明实施例提供的评估模型预测本例恶性风险低，评估结果为甲状腺滤泡腺瘤的示意图；
68.图8是本发明实施例提供的评估模型预测本例恶性风险高，评估结果为甲状腺腺瘤的示意图；
69.图9是本发明实施例提供的对恶性潜能未定的病例no.1获得质谱成像结果示意图。
具体实施方式
70.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
71.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
72.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
73.本发明实施例提供的用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法包括：对甲状腺滤泡性肿瘤标本进行质谱成像扫描；对所有样本完成质谱扫描后获得质谱数据，建立opls-da数学模型；利用分子标志物评估模型对恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤进行良恶性评估。
74.如图1所示，本发明实施例提供的用于甲状腺滤泡性肿瘤鉴别诊断标志物的筛选方法包括以下步骤：
75.s101，收集病理科诊断的甲状腺滤泡性肿瘤标本并确定训练集和测试集；
76.s102，在训练集中获得甲状腺滤泡性肿瘤相关的差异代谢物分子标志物；
77.s103，对差异代谢物分子标志物进行结构鉴定，构建甲状腺滤泡性病变的良恶性评估模型，并在测试集中对评估模型进行验证；
78.s104，通过利用甲状腺滤泡性病变的良恶性评估模型，对恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤进行良恶性评估。
79.本发明对42例(包括15例甲状腺滤泡癌，22例甲状腺滤泡腺瘤，5例恶性潜能未定的甲状腺肿瘤)甲状腺滤泡性肿瘤标本进行质谱成像扫描。首先，发明人在训练集(由10例甲状腺滤泡癌及15例)找出14个甲状腺滤泡性肿瘤相关的代谢物分子标志物，建立评估模型，在测试集(5例甲状腺滤泡癌及7例甲状腺滤泡腺瘤)中对分子标志物评估模型进行验证。进一步，发明人通过利用分子标志物评估模型，对恶性潜能未定的甲状腺滤泡性肿瘤进行良恶性评估。
80.1、临床肿瘤组织样本的收集、制片和扫描前处理
81.组织切片的制备与干燥：制作厚度大约1mm的切片贴于正电荷防脱载玻片表面；每个肿瘤组织共切片5张，其中4张用于正、负离子下质谱扫描，1张进行h&e染色，制片后放置于载玻片盒长期保存；
82.直至实验前取出切片置真空干燥器中，在室温真空干燥约1h。
83.2、肿瘤组织切片的h&e染色
84.①
苏木素染色2～3min，水洗5～10s；
85.②
1％盐酸酒精分化1～3s，水洗1min；
86.③
0.2％氨水反蓝3s，水洗1min；
87.④
1％伊红液染色2min，水洗10s；
88.⑤
脱水透明：80％乙醇稍洗1～2s、95％乙醇(i)2～3s、95％乙醇(ii)3～5s、无水乙醇5～10min、石碳酸二甲苯5～10min、二甲苯(i)2min、二甲苯(ii)2min、二甲苯(iii)2min；
89.⑥
中性树胶封固。
90.3、确定质谱扫描切片实验的各项关键参数，建立成像方法学
91.①
使用afadesi-msi对gep-nens标本切片扫描，确定扫描过程涉及的关键参数，包括：喷雾溶剂组成、样品移动速度、喷雾溶剂流速、离子注入时间、不同质谱扫描范围比较等；
92.②
通过阶梯式的改变其中一项参数数值而维持其余参数不变，考察在该参数设定下获得的质谱数据的强度值，最终确定最适合于gep-nens成像的质谱扫描各项参数，同时考虑到需将数据转化及应用生物信息学进行统计分析，最终建立成像方法与实验路线；
93.4、质谱成像数据的采集
94.①
将与载玻片长边平行的边长作为样品y轴移动的距离，计算y轴方向扫描一行所需时间，此时间也是质谱数据文件的采集时间；
95.②
与载玻片短边平行的边长作为样品x轴移动的距离，计算每一个组织切片样本质谱扫描分析的行数和质谱数据文件数；
96.③
质谱成像数据的采集采用逐行扫描，首先是在y轴方向以0.2mm/s的速度移动切片，相邻两个扫描行之间的步进间隔设定为0.2mm。在每一行扫描结束后，切片所在的载物平移台将以1mm/s的速度沿z轴方向下降2mm，然后以10mm/s的速度迅速返回到同一行的扫描起始点，以避免对未检测样本带来污染和破坏；接着沿x轴步进0.2mm后，z轴方向上升2mm。再按上述步骤开始下一行的扫描分析，循环往复直到完成所有样品区域的扫描分析。其中每一行的扫描数据单独保存为一个.wiff格式的数据文件。
97.5、质谱数据预处理及统计分析
98.①
数据导入与成像图重构：将质谱扫描获取的.raw格式的系列原始数据，首先利用xcalibur中的file converter功能全部转换成.cdf格式，然后在massimager的数据导入窗口输入切片的实际长与宽，一次性批量导入.cdf格式的原始数据生成导入序列，设置质谱峰检测斜率为100，最小峰强度为0，强度积分方式为总强度，质荷比计算方式为加权质荷比，最终获得覆盖全部质荷比范围(100-1000)的组织切片原位成像图；
99.②
可视化处理与成像图分析：从采集得到的afadesi-msi质谱轮廓图中选定能够表征整个组织轮廓的内源性代谢物，输入对应质荷比massimager的离子通道中，获得该离子在组织切片中的分布情况；任意选取出组织切片以外的背景区域，设定质荷比容差为0.005，扣除背景离子以得到更佳的成像效果；导入组织切片的h&e染色图，依次执行缩放、旋转、位移等操作，与代表性离子成像图叠加显示，从而准确选取感兴趣区域(region of interest，roi)，并输出该区域的平均质谱图，以供后续的多元统计分析。
100.③
通过成像软件，对转移组和未转移组标本使用markerview软件进行数据合并，再采用simca-p软件中的pca及opls-da等模型识别方法，进行多变量统计分析研究，对转移组和未转移组进行数据对照分析，寻找与肿瘤转移相关的分子信息；
101.④
使用提取出的统计学意义的质荷比(m/z)对各标本成像，评估各样本质谱成像图，发现各分子空间分布特点与规律；
102.6、各分子结构鉴定
103.①
gep-nens肿瘤组织约100mg，剪碎置于组织匀浆管中，加入4℃预冷的水400μl，再加入3粒陶瓷匀浆珠并拧上匀浆盖；
104.②
将匀浆管固定在组织匀浆机中，设定匀浆参数：频率30s/per time，速度4.0m/s，间隔时间30s，重复4次；
105.③
匀浆完成后，取匀浆液100μl置于1.5ml ep管中，加入400μl乙腈，涡旋2min，4℃离心5min，转速为10000rpm/min；
106.④
上清液转移至另一干净的1.5ml ep管中，置于真空离心浓缩仪中干燥，干燥时间约2h，取出后加入100μl复溶溶剂，离心过滤后进入色谱分析；
107.⑤
设定色谱条件进行线性梯度洗脱程序并进行质谱检测；
108.⑥
通过一级高分辨质谱获得代谢物的离子峰，推测可能的分子式；
283.2638c
18h36
o2fa(18:0)[m-h]-255.2321c
16h32
o2fa(16:0)[m-h]-281.2457c
18h34
o2fa(18:1)[m-h]-279.2291c
18h32
o2fa(18:2)[m-h]-327.2345c
22h32
o2fa(22:6)[m-h]-[0121]
实施例3：代谢物分子标志物用于甲状腺滤泡性病变良恶性鉴别诊断，本实施对12例甲状腺滤泡性病变样本进行鉴别诊断
[0122]
将最终评估结果与病理结果相比较，发现12例甲状腺滤泡性病变(5例甲状腺滤泡癌及7例甲状腺滤泡性病变)，仅有1例预测模型与病理诊断不一致，诊断正确率91％，该结果展现了代谢物分子标志物与临床病理结果高度一致，如图3所示。
[0123]
实施例4：代谢物分子标志物用于甲状腺恶性潜能未定肿瘤的评估
[0124]
no.1评估模型预测本例恶性风险低，评估结果为甲状腺腺瘤(见图4)
[0125]
no.2评估模型预测本例恶性风险高，评估结果为甲状腺滤泡癌(见图5)
[0126]
no.3评估模型预测本例恶性风险高，评估结果为甲状腺滤泡癌(见图6)
[0127]
no.4评估模型预测本例恶性风险低，评估结果为甲状腺滤泡腺瘤(见图7)
[0128]
no.5评估模型预测本例恶性风险高，评估结果为甲状腺腺瘤(见图8)
[0129]
本发明实施例提供的对恶性潜能未定的病例no.1获得质谱成像结果见图9。
[0130]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。