一种动物源性食品中兴奋剂的检测方法与流程

本发明属于食品分析领域，具体涉及一种动物源性食品中兴奋剂的检测方法。

背景技术：

1、β－受体激动剂又称生长促进剂，俗称“瘦肉精”，家畜饲养时加大剂量长期使用，则有降低脂肪、提高瘦肉率、促进生长，改善肉质的作用。β－阻断剂，常用于运输前给动物注射以减轻动物的应激反应，防止因应激反应造成的肉品安全和质量大幅下降，且往往在屠宰前数小时使用，更容易造成药物残留，危害人类健康。农业部250号公告中《食品动物中禁止使用的药物及其他化合物清单》包括了β－兴奋剂类。世界反兴奋剂机构发布的《禁用清单国际标准》规定β－受体激动剂和β－阻断剂为运动员禁止使用的兴奋剂类药物。其中，阿替洛尔、卡替洛尔、美替诺龙、美托洛尔、普萘洛尔、沙美特罗和齐帕特罗分别属于动物饲养过程中常被使用到的β－受体激动剂和β－阻断剂。

2、建立多种兴奋剂的检测可满足食品安全应急事件处置的需要，防止重大赛事中运动员因食用被污染的食品而导致的兴奋剂阳性事件的出现。现食源性兴奋剂的检测常使用气相色谱－串联质谱法(gc-ms/ms)、液相色谱－串联质谱法(lc-ms/ms)、超高效液相色谱－高分辨质谱法(lc-q/hrms)等，其中gc-ms/ms需要衍生，操作繁琐；高分辨质谱仪多用于筛查与确证；lc-ms/ms测定时样品不用衍生化，灵敏度高、定性定量准确，在残留分析中应用最为广泛。我国现行有效的食源性兴奋剂检测标准多以lc-ms/ms为主，其中β－受体激动剂的检测可参考相关标准，β－阻断剂尚无检测标准。

3、专利cn113588828a公开了一种动物源性食品中兴奋剂的检测方法，虽然其能检测出食品中48种兴奋剂，但由于β－受体激动剂和β－阻断剂在动物组织内以结合态存在，其样品处理过程中未酶解，实际检测结果偏低，易造成假阴性；《超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉、鸡蛋、牛奶中9种食源性兴奋剂类药物残留》中虽然通过对样品加酶解，实现了9种兴奋剂的检测，但其猪肉、鸡蛋、牛奶样品基质相对其制品简单，当面对更复杂的食品制品时易受基质效应的影响，同时，经试验证明其方法在检测动物源性食品中兴奋剂含量时，由于ph调节剂和净化方式的影响，导致结果准确性差。

技术实现思路

1、为解决前述问题，本发明提供了一种动物源性食品的兴奋剂检测样品配置方法，它包括如下步骤：

2、1)酶解

3、取待测样品，加内标溶液、乙酸铵缓冲溶液，以及β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶混匀，35～40℃水浴振荡8～15h，降温至20～30℃，加磷酸氢二钾和乙腈混匀，离心，取上清，得提取液；

4、2)净化

5、取步骤1)所得提取液，加quechers吸附剂混匀，离心，取上清液干燥，加体积比1～5：2的甲酸甲醇-甲酸水溶液溶解，过滤，即得待测样品溶液；

6、所述内标溶液为氘代兴奋剂标准品的甲醇溶液。

7、进一步地，步骤1)所述待测样品与内标溶液、乙酸铵缓冲溶液、β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶、磷酸氢二钾和乙腈的质量体积比为1～3g：40～60μl：3～8ml：25～75μl：1～3g：5～15ml，优选2g：50μl：5ml：50μl：2g：10ml。

8、更进一步地，所述待测样品为捣碎均质的畜禽肉及其制品、水产品、蛋及其制品，或搅拌均匀的液体乳，或热熔的乳制品。

9、更进一步地，所述内标溶液中氘代兴奋剂标准品的浓度为0.1～100μg/ml，优选0.1μg/ml；所述氘代兴奋剂为阿替洛尔-d7、卡替洛尔-d9、美替诺龙-d6、美托洛尔-d7、普萘洛尔-d7、沙美特罗-d3和/或齐帕特罗-d7。

10、更进一步地，所述乙酸铵缓冲溶液的浓度为0.1～0.5mol/l，ph为5.0～6.0，优选0.2mol/l，ph为5.2；所述β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶中β-盐酸葡萄糖醛苷酶130000～150000u/ml，芳基硫酸酯酶5000～6000u/ml，优选β-盐酸葡萄糖醛苷酶134600u/ml，芳基硫酸酯酶5200u/ml。

11、进一步地，步骤2)所述提取液、quechers吸附剂、上清液和甲酸甲醇-甲酸水溶液的质量体积比为5～10ml：700～800mg：2～7ml：0.2～0.7ml，优选8ml：740mg：5ml：0.5ml；所述甲酸甲醇-甲酸水溶液为体积比3：2的1％甲酸甲醇-1％甲酸水溶液。

12、进一步地，所述水浴振荡温度37℃，时间12h；所述离心速度9500r/min，时间5min。

13、本发明还提供了一种动物源性食品中兴奋剂的检测方法，它包括如下步骤：

14、a、取兴奋剂标准品，加甲醇溶解稀释成溶液，再加内标溶液和体积比1～5：2的甲酸甲醇-甲酸水溶液混匀，即得标准工作液；

15、b、分别将前述所得待测样品溶液和步骤a所得标准工作液注入液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪；色谱条件如下：

16、色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以0.1％甲酸水溶液为流动相a，以0.1％甲酸乙腈溶液为流动相b；

17、梯度洗脱程序为：

18、

19、

20、质谱条件：电喷雾离子源正离子模式；质谱检测模式为多离子反应监测；

21、所述内标溶液为氘代兴奋剂标准品的甲醇溶液；

22、所述兴奋剂为阿替洛尔、卡替洛尔、美替诺龙、美托洛尔、普萘洛尔、沙美特罗和/或齐帕特罗。

23、进一步地，步骤a所述溶液、内标溶液和体积比3：2的甲酸甲醇-甲酸水混合溶液的体积比为10～200：50：750～940；所述溶液的浓度为200ng/ml～1mg/ml；所述内标溶液中氘代兴奋剂标准品的浓度为0.1～100μg/ml，优选0.1μg/ml；所述甲酸甲醇-甲酸水溶液为体积比3：2的1％甲酸甲醇-1％甲酸水溶液。

24、进一步地，步骤b所述色谱柱为acquity uplc beh c18，3.0×100mm，1.7μm；所述色谱条件中流速0.4ml/min，柱温40℃，进样量2μl；所述质谱条件中干燥气温度250℃，干燥气流量11l/min，雾化气压力35psi，鞘气温度400℃，鞘气流量：12l/min，毛细管电压4000v。

25、进一步地，步骤c所述质谱条件中阿替洛尔定性检测离子对m/z 267.1→m/z145.0，碎裂电压120v，碰撞能31v，定量检测离子对m/z 267.1→m/z 190.0，碎裂电压120v，碰撞能20v；阿替洛尔-d7定量检测离子对m/z 274.1→m/z190.0，碎裂电压120v，碰撞能21v；

26、卡替洛尔定性检测离子对m/z 293.1→m/z 202.0，碎裂电压120v，碰撞能24v，定量检测离子对m/z 293.1→m/z 237.0，碎裂电压120v，碰撞能15v；卡替洛尔-d9定量检测离子对m/z 302.1→m/z 238.0，碎裂电压120v，碰撞能15v；

27、美替诺龙定性检测离子对m/z 303.1→m/z187.1，碎裂电压120v，碰撞能24v，定量检测离子对m/z 303.1→m/z 83.1，碎裂电压120v，碰撞能25v；美替诺龙-d6定量检测离子对m/z 309.1→m/z 87.1，碎裂电压120v，碰撞能26v；

28、美托洛尔定性检测离子对m/z 268.1→m/z 133.1，碎裂电压120v，碰撞能29v，定量检测离子对m/z 268.1→m/z 159.1，碎裂电压120v，碰撞能23v；美托洛尔-d7定量检测离子对m/z 275.1→m/z159.1，碎裂电压120v，碰撞能23v；

29、普萘洛尔定性检测离子对m/z 260.1→m/z 183.1，碎裂电压120v，碰撞能18v，定量检测离子对m/z 260.1→m/z116.1，碎裂电压120v，碰撞能19v；普萘洛尔-d7定量检测离子对m/z 267.1→m/z 116.1，碎裂电压120v，碰撞能20v；

30、沙美特罗定性检测离子对m/z 416.1→m/z232.1，碎裂电压120v，碰撞能23v，定量检测离子对m/z 416.1→m/z 380.1，碎裂电压120v，碰撞能22v；沙美特罗-d3定量检测离子对m/z 419.1→m/z 383.1，碎裂电压120v，碰撞能21v；

31、齐帕特罗定性检测离子对m/z 262.1→m/z 202.1，碎裂电压120v，碰撞能20v，定量检测离子对m/z 262.1→m/z 185.1，碎裂电压120v，碰撞能27v；齐帕特罗-d7定量检测离子对m/z 269.1→m/z 251.1，碎裂电压120v，碰撞能12v。

32、进一步地，所述待测样品溶液的色谱图中呈现与标准品工作液的色谱图中定性离子、定量离子保留时间一致的色谱峰，且色谱峰的定性离子、定量离子相对丰度比与相当浓度标准工作溶液色谱峰的定性离子、定量离子相对丰度比的偏差不超过规定的最大允许偏差范围，确定待测样品中含有兴奋剂；所述规定的最大允许偏差范围如下：

33、

34、更进一步地，所述待测样品中兴奋剂的含量按外标法以峰面积计算。

35、本发明所述“相当浓度标准品溶液”是指兴奋剂的浓度为供试品溶液中兴奋剂浓度+30％的标准工作溶液。

36、本发明对不同食品消化酶、以及酶解液不同ph环境和净化方式进行深入研究，发现以β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶消化动物食品，并在酶解液中定量加入磷酸氢二钾，更容易使兴奋剂从离子态转化成分子态，从而被乙腈萃取出来，同时采用quechers吸附剂净化，避免了基质效应的影响，确保了检测的准确性。通过本发明动物源性食品兴奋剂检测样品的配置方法，不同动物食品样品中兴奋剂均能被完全提取，且避免了样品溶液在检测时的基质效应，解决了现有技术中兴奋剂不能从动物制品中完全无损失的提取出，以及检测样品杂质的干扰。

37、本发明动物源性食品中兴奋剂的检测方法，兼顾了测定不同动物食品的兴奋剂含量，具有较好的通用性和专属性，灵敏度高，操作方便，分析时间适中，为动物源性食品中兴奋剂含量准确检测提供了有效保障，保证了运动员饮食安全，具有良好的应用前景。

38、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

39、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。