一种高效液相色谱法测定左卡尼汀有关物质的方法与流程

1.本发明属于物质检测技术领域，涉及一种高效液相色谱法(hplc)测定左卡尼汀有关物质的方法，尤其是涉及一种高效液相色谱法测定左卡尼汀中杂质3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵的方法。


背景技术：

2.左卡尼汀为用于治疗慢性肾衰长期血透病人因继发性肉碱缺乏产生的一系列并发症状的药物，主要用于治疗如心肌病、骨骼肌病、心律失常、高脂血症，以及低血压和透析中肌痉挛等。
3.左卡尼汀化学名是(3r)-羟基-(三甲基铵)丁酸内盐，在化学合成会引入主要杂质：3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a)、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c)铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵(杂质d)。
4.左卡尼汀为左卡尼汀注射液中主要活性成分，通过测定左卡尼汀中有关物质，可以较好的反映左卡尼汀的质量。目前，中国药典2020版中左卡尼汀有关物质采用的色谱条件如下：用氨基硅烧键合硅胶为填充剂；以50mmol/l磷酸二氢钾溶液(用氢氧化钠试液调节ph值至4.7)-乙腈(35:65v/v)为流动相；检测波长为205nm；柱温为30℃；进样体积20μl。在此色谱条件，系统适用性溶液色谱图如图1，杂质c和杂质d保留时间一致，不能有效分离。
5.因此，建立一种高灵敏度的测定左卡尼汀中的有关物质的方法，可以更好的控制左卡尼汀的质量


技术实现要素：

6.本发明的目的在于建立一种基于高效液相色谱法测定左卡尼汀有关物质3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵的方法，以更好的控制左卡尼汀的质量。
7.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
8.一种高效液相色谱法测定左卡尼汀有关物质的方法，包括：
9.配制系统适用性溶液：取3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和左卡尼汀对照品，采用流动相和水的混合溶剂配制成每1ml混合溶剂含15～30μg3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、3～7μg(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和3～7μg(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和3～15mg左卡尼汀的对照品溶液；
10.配制供试品溶液：取左卡尼汀，采用流动相和水的混合溶剂配制成每1ml混合溶剂含4mg～6mg左卡尼汀的供试品溶液；
11.分别对系统适用性溶液、供试品溶液进行hplc检测，hplc检测的色谱条件为：采用有机混合硅胶颗粒上化学键合了二羟基丙基的亲水性作用色谱柱，流动相为乙腈和50～
60mmol/l磷酸二氢钾溶液体积比为65:35～75:25的混合溶液，柱温为25～35℃，流速为0.8～1.2ml/min，检测波长为200～210nm；进样量5μl～100μl；
12.采用外标法测定左卡尼汀中杂质3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵的含量；
13.其中，所述的混合溶剂由流动相和水按照体积比为40:60～60:40配制而成；磷酸二氢钾溶液的ph值为4.3～5.5。
14.优选的，配制系统适用性溶液：取3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和左卡尼汀对照品，采用流动相和水的混合溶剂配制成每1ml混合溶剂含25μg3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、5μg(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和5μg(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和5mg左卡尼汀的对照品溶液。
15.优选的，配制供试品溶液：取左卡尼汀，采用流动相和水的混合溶剂配制成每1ml混合溶剂含5mg左卡尼汀的供试品溶液。
16.优选的，所述的有机混合硅胶颗粒上化学键合了二羟基丙基的亲水性作用色谱柱为hilic色谱柱(柱长250mm
×
内径4.6mm，粒径5μm)。
17.优选的，所述的流动相为乙腈和50～60mmol/l磷酸二氢钾溶液体积比为75:25的混合溶液。
18.优选的，磷酸二氢钾溶液的ph值为4.7。
19.优选的，所述的流速为1.0ml/min。
20.优选的，所述的检测波长为205nm。
21.优选的，所述的进样量为10μl～20μl。
22.优选的，所述的混合溶剂由流动相和水按照体积比为50:50配制而成。
23.作为本发明所述的高效液相色谱法测定左卡尼汀有关物质的方法的进一步优选技术方案，还包括：
24.配制对照溶液：精密量取供试品溶液适量，采用流动相和水的混合溶剂配制成每1ml混合溶剂含0.02mg～0.03mg左卡尼汀的供试品溶液；
25.对对照溶液进行hplc检测，hplc检测的色谱条件与供试品溶液的hplc检测的色谱条件相同；
26.采用自身对照法测定左卡尼汀中的未知杂质。
27.优选的，配制对照溶液：精密量取供试品溶液适量，采用流动相和水的混合溶剂配制成每1ml混合溶剂含0.025mg左卡尼汀的供试品溶液。
28.作为本发明所述的高效液相色谱法测定左卡尼汀有关物质的方法的进一步优选技术方案，还包括：
29.配制灵敏度溶液：精密量取对照溶液适量，采用流动相和水的混合溶剂配制成每1m混合溶剂含0.002mg～0.003mg左卡尼汀的供试品溶液；
30.对灵敏度溶液进行hplc检测，hplc检测的色谱条件与供试品溶液的hplc检测的色谱条件相同。
31.优选的，配制灵敏度溶液：精密量取对照溶液适量，流动相-水(50:50v/v)配制成
每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.0025mg左卡尼汀的供试品溶液。
32.所述的高效液相色谱法采用的检测器为紫外吸收检测器。
33.本发明的有益效果：
34.本发明基于高效液相色谱法，采用有机混合硅胶颗粒上化学键合了二羟基丙基的亲水性作用色谱柱测定左卡尼汀有关物质3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵，分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高，通过检测左卡尼汀有关物质，控制左卡尼汀有关物质3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵不大于0.3％，(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵不大于0.10％，任意单杂不大于0.10％，其他任意单杂的总杂不大于0.5％，能够有效控制左卡尼汀的质量。
附图说明
35.图1为中国药典2020版中左卡尼汀有关物质采用的色谱条件下的hplc谱图。
36.图2为实施例1系统适用性溶液的hplc谱图(1号峰是杂质d，2号峰是杂质c，3号峰是左卡尼汀，4号峰是杂质a)。
37.图3为实施例1供试品溶液的hplc谱图(1号峰是左卡尼汀，2号峰是杂质a)。
38.图4为实施例1灵敏度溶液的hplc谱图(1号峰是左卡尼汀)。
39.图5为实施例2系统适用性溶液的hplc谱图(1号峰是杂质d，2号峰是杂质c，3号峰是左卡尼汀，4号峰是杂质a)。
40.图6为实施例2供试品溶液hplc谱图(1号峰是左卡尼汀，2号峰是杂质a)。
41.图7为实施例3系统适用性溶液的hplc谱图(1号峰是杂质d，2号峰是杂质c，3号峰是左卡尼汀，4号峰是杂质a)。
42.图8为实施例3供试品溶液hplc谱图(1号峰是左卡尼汀，2号峰是杂质a)。
43.图9为实施例4系统适用性溶液的hplc谱图(1号峰是杂质d，2号峰是杂质c，3号峰是左卡尼汀，4号峰是杂质a)。
44.图10为实施例4供试品溶液hplc谱图(1号峰是左卡尼汀，2号峰是杂质a)。
45.图11为实施例5系统适用性溶液的hplc谱图(1号峰是杂质d，2号峰是杂质c，3号峰是左卡尼汀，4号峰是杂质a)。
46.图12为实施例5供试品溶液hplc谱图(3号峰是左卡尼汀，4号峰是杂质a)。
47.图13为实施例6定量限溶液的hplc谱图(1号峰是左卡尼汀)。
48.图14为实施例6检测限溶液hplc谱图(1号峰是左卡尼汀)。
具体实施方式
49.通过下列实施例进一步说明本发明的技术方案，但实施例并非限制本发明的。
50.实施例中所用试剂均为市售或依据现有方法进行简单合成。
51.高效液相色谱仪型号：
52.53.实施例1～实施例6色谱柱为hilic(250mm
×
4.6mm，5μm)。
54.所用试剂：
[0055][0056]
实施例1
[0057]
高效液相色谱法测定左卡尼汀中有关物质的方法，包括：
[0058]
系统适用性溶液的配制：取3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和左卡尼汀对照品，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含25μg3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、5μg(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和5μg(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和5mg左卡尼汀的系统适用性溶液。
[0059]
供试品溶液的配制：取左卡尼汀，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含5mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0060]
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0061]
灵敏度溶液的配制：精密量取对照溶液适量，流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.0025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0062]
测定：分别吸入系统适用性溶液，供试品溶液，对照溶液和灵敏度溶液各10μl，注入液相色谱仪进行hplc检测，hplc检测的色谱条件为：采用hilic色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相为乙腈和50mmol/l磷酸二氢钾溶液(ph为4.7)体积比为75:25的混合溶剂，流速为1.0ml/min，检测波长为205nm；柱温为30℃。
[0063]
本实施例系统适用性溶液的hplc谱图见图2，可见，在本实施例色谱条件下，(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵(杂质d，1号峰)与(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c，2号峰)、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c)与左卡尼汀(3号峰)、左卡尼汀与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a，4号峰)之间的分离度均大于1.5。且左卡尼汀与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a)分离度大于2.0，优于中国药典2020年版中规定左卡尼汀与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a)分离度不小于1.0。说明本发明方法能够更有效的控制3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a)量，从而可更有效的控制产品质量。
[0064]
本实施例供试品溶液的hplc谱图见图3，显示含有杂质a(2号峰)，采用外标法可以测定左卡尼汀中杂质a的含量。
[0065]
本实施例灵敏度溶液的hplc图谱见图4，显示左卡尼汀的信噪比(s/n)是12.75，灵敏度满足要求，可以有效的控制左卡尼汀的质量。
[0066]
实施例2
[0067]
本实施例调整流动相中缓冲盐溶液的ph值为4.3。
[0068]
高效液相色谱法测定左卡尼汀中有关物质的方法，包括：
[0069]
系统适用性溶液的配制：取3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和左卡
尼汀对照品，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含25μg3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、5μg(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和5μg(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和5mg左卡尼汀的系统适用性溶液。
[0070]
供试品溶液的配制：取左卡尼汀，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含5mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0071]
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0072]
灵敏度溶液的配制：精密量取对照溶液适量，流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.0025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0073]
测定：分别吸入系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液和灵敏度溶液各10μl，注入液相色谱仪进行hplc检测，hplc检测的色谱条件为：采用hilic色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-50mmol/l磷酸二氢钾溶液(ph为4.3)的体积比为75:25的混合溶剂，流速为1.0ml/min，检测波长为205nm；柱温为30℃。
[0074]
本实施例系统适用性溶液的hplc谱图见图5，可见，把缓冲盐溶液的ph调至4.3后，(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵(杂质d，1号峰)与(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c，2号峰)、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c)与左卡尼汀(3号峰)、左卡尼汀与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(4号峰，杂质a)相互之间的分离度均大于1.5。说明调整缓冲盐溶液的ph调至4.3后，对各成分之间的分离度无明显影响。
[0075]
本实施例供试品溶液的hplc谱图见图6，显示含有杂质a(2号峰)，采用外标法可以测定左卡尼汀中杂质a的含量。
[0076]
根据本实施例灵敏度溶液的hplc谱图可知左卡尼汀的信噪比(s/n)是19.62，灵敏度满足要求，可以有效的控制左卡尼汀的质量。
[0077]
实施例3
[0078]
本实施例调整流动相中缓冲盐溶液的ph值为5.5。
[0079]
高效液相色谱法测定左卡尼汀中有关物质的方法，包括：
[0080]
系统适用性溶液的配制：取3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和左卡尼汀对照品，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含25μg3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、5μg(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和5μg(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和5mg左卡尼汀的系统适用性溶液。
[0081]
供试品溶液的配制：取左卡尼汀，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含5mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0082]
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0083]
灵敏度溶液的配制：精密量取对照溶液适量，流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.0025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0084]
测定：分别吸入系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液和灵敏度溶液各10μl，注入液相色谱仪进行hplc检测，hplc检测的色谱条件为：采用hilic色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μ
m)，流动相为乙腈-50mmol/l磷酸二氢钾溶液(ph为5.5)的体积比为75:25的混合溶剂，流速为1.0ml/min，检测波长为205nm；柱温为30℃。
[0085]
本实施例系统适用性溶液的hplc谱图见图7，可见，把流动相中的缓冲盐溶液ph调至5.5后，(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵(杂质d，1号峰)与(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c，2号峰)、左卡尼汀(3号峰)与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a，4号峰)相互之间的分离度均大于1.5，(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c)与左卡尼汀分离度大于1.0。说明调整缓冲盐溶液的ph调至5.5后，不影响左卡尼汀与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a)的分离度。
[0086]
本实施例供试品溶液hplc谱图见图8，显示含有杂质a(2号峰)，采用外标法可以测定左卡尼汀中杂质a的含量。
[0087]
根据本实施例灵敏度溶液的hplc谱图可知左卡尼汀的信噪比(s/n)是15.38，灵敏度满足要求，可以有效的控制左卡尼汀的质量。
[0088]
实施例4
[0089]
本实施例调整进样量为20μl。
[0090]
高效液相色谱法测定左卡尼汀中有关物质的方法，包括：
[0091]
系统适用性溶液的配制：取3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和左卡尼汀对照品，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含25μg3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、5μg(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和5μg(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和5mg左卡尼汀的系统适用性溶液。
[0092]
供试品溶液的配制：取左卡尼汀，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含5mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0093]
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0094]
灵敏度溶液的配制：精密量取对照溶液适量，流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.0025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0095]
测定：分别吸入系统适用性溶液，供试品溶液，对照溶液和灵敏度溶液20μl，注入液相色谱仪进行hplc检测，所述hplc检测的色谱条件为：采用：hilic色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-50mmol/l磷酸二氢钾溶液(ph为4.7)的体积比为75:25的混合溶剂，流速为1.0ml/min，检测波长为205nm；柱温为30℃。
[0096]
本实施例系统适用性溶液的hplc谱图见图9，可见，加大进样量后，(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵(杂质d，1号峰)与(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c，2号峰)、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c)与左卡尼汀(3号峰)、左卡尼汀与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a，4号峰)相互之间的分离度均大于1.5。说明加大进样量不影响各成分之间的分离度。
[0097]
本实施例供试品溶液hplc谱图见图10，显示含有杂质a(2号峰)，采用外标法可以测定左卡尼汀中杂质a的含量。
[0098]
根据本实施例灵敏度溶液的hplc谱图可知左卡尼汀的信噪比(s/n)是13.21，灵敏度满足要求，可以有效的控制左卡尼汀的质量。
[0099]
实施例5
[0100]
本实施例调整流动相中缓冲盐的浓度为60mmol/l。
[0101]
高效液相色谱法测定左卡尼汀中有关物质的方法，包括：
[0102]
系统适用性溶液的配制：取3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和左卡尼汀对照品，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含25μg3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、5μg(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和5μg(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和5mg左卡尼汀的系统适用性溶液。
[0103]
供试品溶液的配制：取左卡尼汀，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含5mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0104]
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.025mg左卡尼汀的供试品溶液；。
[0105]
灵敏度溶液的配制：精密量取对照溶液适量，流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.0025mg左卡尼汀的供试品溶液；
[0106]
测定：分别吸入系统适用性溶液，供试品溶液，对照溶液和灵敏度溶液10μl，注入液相色谱仪进行hplc检测，所述hplc检测的色谱条件为：采用：hilic色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-60mmol/l磷酸二氢钾溶液(ph为4.7)的体积比为75:25的混合溶剂，流速为1.0ml/min，检测波长为205nm；柱温为30℃。
[0107]
本实施例系统适用性溶液的hplc谱图见图11，可见，把缓冲盐溶液的浓度调整为60mmol/l后，(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵(杂质d，1号峰)与(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c，2号峰)、左卡尼汀(3号峰)与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a，4号峰)相互之间的分离度均大于1.5，(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵(杂质c)与左卡尼汀分离度大于1.0。说明把流动相中的缓冲盐溶液的浓度调整为60mmol/l后，左卡尼汀与3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵(杂质a)的分离度依然大于1.5。
[0108]
本实施例供试品溶液hplc谱图见图12，显示含有杂质a(4号峰)及未知杂质(1号峰、2号峰)，采用外标法可以测定左卡尼汀中杂质a的含量，采用自身对照法测定左卡尼汀中的未知杂质。
[0109]
根据本实施例灵敏度溶液的hplc谱图可知左卡尼汀的信噪比(s/n)是14.56，灵敏度满足要求，可以有效的控制左卡尼汀的质量。
[0110]
实施例6
[0111]
高效液相色谱法测定左卡尼汀中有关物质的方法，包括：
[0112]
系统适用性溶液的配制：取3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和左卡尼汀对照品，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含25μg3-羧基-n,n,n-三甲丙烯-2-烯-1-氯化铵、5μg(r)-4-氨基-2-羟基-n,n,n-三甲基-4-氧代丁基-1-氯化铵和5μg(3-氨基甲酰烯丙基)三甲基铵和5mg左卡尼汀的系统适用性溶液。
[0113]
供试品溶液的配制：取左卡尼汀，加流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含5mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0114]
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.025mg左卡尼汀的供试品溶液。
[0115]
定量限溶液(灵敏度溶液)的配制：精密量取对照溶液适量，流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.00125mg左卡尼汀的供试品溶液。相当于供试品浓度的0.025％。
[0116]
检测限溶液的配制：精密量取对照溶液适量，流动相-水(50:50v/v)配制成每1ml流动相-水(50:50v/v)含0.0005mg左卡尼汀的供试品溶液。相当于供试品浓度的0.01％。
[0117]
测定：分别吸入系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液、定量限溶液、检测限溶液和灵敏度溶液各20μl，注入液相色谱仪进行hplc检测，所述hplc检测的色谱条件为：采用hilic色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-50mmol/l磷酸二氢钾溶液(ph为4.7)的体积比为75:25的混合溶剂，流速为1.0ml/min，检测波长为205nm；柱温为30℃。
[0118]
本实施例定量限溶液的hplc谱图见图13，1号峰是左卡尼汀；本实施例检测限溶液hplc谱图见图14，1号峰是左卡尼汀。
[0119]
在中国药典2020年版左卡尼汀有关物质中灵敏度溶液浓度相当于是供试品溶液浓度的0.05％；而本发明检测方法中，灵敏度溶液浓度相当于供试品溶液浓度的0.025％，方法的灵敏度更高。故本发明方法的分离度及灵敏度均好于现行中国药典2020年版有关物质检测的分离度及灵敏度，说明本发明方法可以更加有效的控制产品的质量。