核酸特异位点修饰的ECL检测方法、基底电极、传感器及它们的制备方法、以及试剂盒与流程

本发明涉及基于界面增强和纳米信标的核酸特异位点修饰的电化学发光(ecl)检测方法、ecl检测方法中使用的基底电极、传感器及它们的制备方法、以及试剂盒。

背景技术：

1、核酸，例如dna和rna中存在着大量的化学修饰，这些化学修饰在不改变核酸序列的前提下，作为一种调控机制动态地调节着基因的表达。

2、dna甲基化(dna methylation)是一类发生在胞嘧啶5号位碳原子上、可稳定遗传的表观修饰，在动、植物基因组中广泛存在。dna甲基化在哺乳动物的生长发育过程中广泛参与多种生理过程，包括基因沉默、基因印记(genomic imprinting)、x染色体失活以及疾病的发生等。

3、部分肿瘤的发生伴随着特定基因的高甲基化事件，而且基因局部的高甲基化事件早于细胞的恶性增生发生，因此特定基因的甲基化水平的检测可作为肿瘤早期预测和诊断的重要依据之一。例如，早期的结直肠癌(crc)筛查检测即是基于表观遗传的生物标志物进行的，fda已批准通过检测特定基因启动子cpg甲基化的增加来进行crc的早期筛查和辅助诊断(参见非专利文献1)。另外，不同肿瘤类型发生高甲基化的抑癌基因不同，例如卵巢癌中，抑癌基因rassf1a、brca1、apc、cdkn2a等呈高甲基化状态，乳腺癌中，抑癌基因pcdhb15、wbscr17、igf1、gypc等呈高甲基化状态(参见非专利文献2)。通过对这些特定抑癌基因甲基化水平进行检测，不仅可加强特定肿瘤的筛查和诊断，而且也有助于肿瘤针对性治疗效果的评估以及预后观察。

4、目前dna甲基化检测的标准方法是亚硫酸氢盐处理，具体而言，通过用亚硫酸氢盐、例如亚硫酸氢钠处理dna，可以将dna中的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，但是发生了甲基化的5-甲基胞嘧啶(5-mc)则保持不变，由此通过随后的pcr或测序即可将5-mc与c区分开，从而实现对甲基化dna的检测。

5、但是，亚硫酸氢盐处理需要在严格的化学和温度条件下进行，且pcr或测序检测操作复杂，需要专业技术人员以及专业设备，使得该检测方法效率低、耗时长、成本高。因此，迫切需要发展简单、快速、灵敏的甲基化dna检测方法。

6、近期，基于特异性抗体对甲基化位点识别的甲基化dna检测方法引起了关注。这类检测方法不需要核酸预处理，且可以通过对特异性抗体标记不同信标，进行电化学(例如非专利文献3)、荧光等检测。

7、近年发展起来的ecl技术已在生物分析，例如肿瘤蛋白标记物检测方面得到广泛应用(例如非专利文献4)。ecl技术是利用电化学原理在电极表面进行电化学反应产生激发态而引发特异性发光的方法。由于ecl是电致发光，相对于荧光而言，不需要外加激发光源且没有光漂白和光干扰等影响，因此具有设备简单、成本低廉、背景信号低、检测灵敏度高等优点。

8、但是，目前的ecl检测方法的灵敏度、特异性等检测性能还需要进一步的提高。

9、现有技术文献

10、非专利文献

11、非专利文献1：yvette n lamb et al.，epi2.0ce：a blood-basedscreening test for colorectal cancer，mol diagn ther.2017 apr；21(2):225-232

12、非专利文献2：洪婷婷，dna表观遗传修饰的特异性检测，武汉大学，2017年，博士学位论文

13、非专利文献3：eloy povedano et al.，amperometric bioplatforms to detectregional dna methylation with single-base sensitivity，anal.chem，2020，92，5604-12

14、非专利文献4：xiaoming zhou et al.，synthesis，labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2`-bipyridyl)ruthenium(ii)-based electrochemiluminescence probe，nat protoc 2014may；9(5)

技术实现思路

1、本发明所要解决的课题

2、本发明的发明人通过采用ecl纳米信标并结合特异性抗体对甲基化位点的识别反应，提供了一种对核酸特异位点修饰进行简单、灵敏、快速且通用的电化学发光检测方法，并提交了中国专利申请(申请号：202210592343.6)。

3、在此基础上，发明人进一步在增强ecl检测信号、提高检测灵敏度和特异性等方面进行了深入研究，结果发现，通过对电极表面进行纳米功能化修饰，能够制备具有界面增强效应的ecl基底电极、传感器，从而提高了ecl检测灵敏度。

4、即，本发明通过基于界面增强和纳米信标的ecl技术，能够提供一种灵敏度高、特异性强、检测限低的核酸特异位点修饰的ecl检测方法。

5、用于解决课题的手段

6、具体而言，本发明提供下述技术方案。

7、[1]一种ecl基底电极的制备方法，其包含下述工序：

8、将电催化剂溶液与金属纳米粒子混合后滴加到电极表面，得到电催化剂-金属纳米粒子共修饰的基底电极。

9、[2]根据[1]所述的制备方法，其中，所述电催化剂为过渡金属化合物。

10、[3]根据[1]或[2]所述的制备方法，其中，所述电催化剂为二硒化钼(mose2)。

11、[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，所述金属纳米粒子为选自金(au)纳米粒子、银(ag)纳米粒子、铂(pt)纳米粒子、铜(cu)纳米粒子、钴(co)纳米粒子、铁(fe)纳米粒子、镍(ni)纳米粒子和它们的多元合金纳米粒子中的至少一种。

12、[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，所述金属纳米粒子为金(au)纳米粒子。

13、[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，所述电极为选自玻碳电极(gce)、ito电极、和丝网印刷电极(spe)中的一种。

14、[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，所述电极为玻碳电极(gce)。

15、[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂的剥离时间为5小时以上。

16、[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂的剥离时间为5～25小时。

17、[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂与所述金属纳米粒子的混合比例以3.5mg/ml的mose2和0.5mg/ml aunps的体积比计，为1:1～1:9。

18、[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂与所述金属纳米粒子的混合比例以3.5mg/ml的mose2和0.5mg/mlaunps的体积比计，为1:5～1:7。

19、[12]一种ecl基底电极，其是通过[1]～[11]中任一项所述的制备方法制备的。

20、[13]一种ecl传感器的制备方法，其包含下述工序：

21、通过[1]～[11]中任一项所述的制备方法制备ecl基底电极的工序，和

22、使经修饰的捕获核酸结合到所述基底电极表面的工序。

23、[14]根据[13]所述的制备方法，其中，所述经修饰的捕获核酸为巯基修饰、氨基修饰、或生物素修饰的捕获核酸。

24、[15]根据[14]所述的制备方法，其中，所述经修饰的捕获核酸为巯基修饰的捕获核酸。

25、[16]根据[13]～[15]中任一项所述的制备方法，其进一步包含采用封闭剂将结合了所述捕获核酸的电极表面封闭的工序。

26、[17]根据[16]所述的制备方法，其中，所述封闭剂为小分子封闭剂和/或蛋白质封闭剂。

27、[18]根据[17]所述的制备方法，其中，所述小分子封闭剂为6-巯基-1-己醇(mch)。

28、[19]根据[17]所述的制备方法，其中，所述蛋白质封闭剂为牛血清白蛋白(bsa)。

29、[20]一种ecl传感器，其是通过[13]～[19]中任一项所述的制备方法制备的。

30、[21]一种核酸特异位点修饰的ecl检测方法，其使用了[20]所述的ecl传感器，并包含如下工序：

31、工序1：在所述传感器表面滴加待测样品，通过捕获核酸将目标核酸捕获到所述传感器表面，

32、工序2：滴加抗核酸修饰的抗体，使其与所述目标核酸上的核酸特异位点结合，

33、工序3：加入ecl纳米信标，对所述目标核酸进行检测信号标记，和

34、工序4：将工序3中得到的传感器放入含有共反应剂的检测溶液中进行ecl信号测定。

35、[22]根据[21]所述的检测方法，其中，所述ecl纳米信标为二抗修饰了的金属掺杂无机氧化物纳米粒子，所述二抗是与所述抗核酸修饰的抗体可发生亲和结合的抗体。

36、[23]根据[22]所述的检测方法，其中，所述无机氧化物纳米粒子为二氧化硅纳米粒子、二氧化钛纳米粒子、氧化锌纳米粒子、或氧化铁纳米粒子、或者包覆有二氧化硅、二氧化钛、氧化锌或氧化铁的纳米粒子。

37、[24]根据[22]或[23]所述的检测方法，其中，所述无机氧化物纳米粒子是二氧化硅纳米粒子。

38、[25]根据[22]～[24]中任一项所述的检测方法，其中，所述金属掺杂无机氧化物纳米粒子为掺杂三(2,2’-联二吡啶)钌(ⅱ)配合物离子(ru(bpy)32+)的二氧化硅纳米粒子。

39、[26]根据[21]～[25]中任一项所述的检测方法，其中，所述共反应剂为三丙胺。

40、[27]根据[21]～[26]中任一项所述的检测方法，所述核酸修饰为核酸的甲基化修饰、羟甲基化修饰或甲酰化修饰。

41、[28]根据[21]～[27]中任一项所述的检测方法，其中，检测溶液的ph为6.0以上、捕获核酸的浓度为1nm～400nm、捕获核酸的孵育时间为5分钟以上、目标核酸的孵育时间为5分钟以上、抗核酸修饰的抗体的浓度为1μg/ml以上、抗核酸修饰的抗体的孵育时间为5分钟以上、ecl纳米信标的浓度为1μg/ml以上、和ecl纳米信标的孵育时间为5分钟以上。

42、[29]根据[21]～[28]中任一项所述的检测方法，其中，ecl检测溶液的ph为6.5～8.5、捕获核酸的浓度为20nm～100nm、捕获核酸的孵育时间为10分钟以上、目标核酸的孵育时间为10分钟以上、抗核酸修饰的抗体的浓度为2μg/ml以上、抗核酸修饰的抗体的孵育时间为10分钟以上、ecl纳米信标的浓度为2μg/ml以上、和ecl纳米信标的孵育时间为10分钟以上。

43、[30]用于[21]～[29]中任一项所述的检测方法的核酸修饰检测用试剂盒，其包含：

44、[12]所述的ecl基底电极或[20]所述的ecl传感器，

45、根据需要的经修饰的捕获核酸，

46、抗核酸修饰的抗体，

47、ecl纳米信标，和

48、检测溶液。

49、[31]一种ecl基底电极，其是电催化剂-金属纳米粒子共修饰的基底电极。

50、[32]根据[31]所述的ecl基底电极，其不包含石墨烯。

51、发明效果

52、(1)本发明中核酸特异位点修饰的检测通过核酸杂交捕获和特异性抗体对修饰位点、例如甲基化位点的识别标记来实现，因此无需传统检测方法中的核酸预处理和pcr扩增过程，方法简单，检测效率高。

53、(2)本发明利用电催化剂和金属纳米粒子共修饰基底电极，构建ecl增强界面，有效提高了ecl信号。

54、(3)本发明通过结合界面增强和纳米信标的双放大策略，极大提高了ecl方法的检测灵敏度，对核酸特异位点修饰的检测限可低至fm级。

55、(4)本发明对检测核酸特异位点修饰具有通用性，通过设计不同的捕获核酸及利用不同的特异性抗体，可对不同的目标核酸特异位点修饰进行检测。