一种检测外泌体蛋白的方法及检测试剂盒与流程

本发明属于生物检测，具体涉及一种检测外泌体蛋白的方法及检测试剂盒。

背景技术：

1、外泌体是一种囊泡状的有脂质双层膜结构的小泡，典型的外泌体有茶托样的外形，且由绝大多数细胞内出芽分泌而出。外泌体的直径30-200nm左右，由于体积小，可以在体液、血液等液体中自由流动。诸多学者从外泌体的蛋白质组学、转录组学等多角度研究，显示外泌体内有非常丰富的内容物，有众多的跨膜蛋白、膜内蛋白、dna、rna等。对于外泌体的功能研究结果显示出，外泌体作为细胞与细胞之间沟通的载体，参与了众多的生物学过程，包括炎症反应、调控因子转移等。最重要的是，癌症作为全球致死性比较多的疾病，其发生发展、转移、侵袭的过程中，外泌体居然也起了非常关键的作用。所以对于肿瘤诊疗研究，外泌体也有非常重大的研究价值。外泌体包含许多与肿瘤研究相关的蛋白质，尤其是临床用药指导相关的蛋白质，如pd-l1蛋白、alk蛋白、her2蛋白等也有表达。

2、对于外泌体蛋白的检测方法主要有免疫组织化学法检测、原位杂交法检测、实时荧光定量pcr、fish、二代测序、elisa法等。以外泌体her2蛋白为例，在研究过程中使用elisa检测方法我们发现裂解后的外泌体her2蛋白比外泌体表面的her2蛋白表达量更多，但是在对裂解以后的外泌体进行磁珠法化学发光检测her2蛋白时发现裂解体系内的偶联磁珠对检测体系影响非常大。为了提高检测的灵敏性，使用化学发光法能够检测到外泌体总her2蛋白表达情况，如何实现适量的血浆中高灵敏的外泌体总her2蛋白检测，是目前需要解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是，提供一种检测外泌体蛋白的方法及检测试剂盒。主要解决现有技术中外泌体膜上和膜内总蛋白检测灵敏度不高的技术问题。

2、本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

3、一种检测外泌体蛋白的方法，该方法为：采用嗜硫磁珠作为载体，与带有二硫键长臂生物素的外泌体蛋白抗体1进行偶联，与目标蛋白结合后利用夹心法再连接外泌体蛋白抗体2-发光标记物试剂形成偶联复合物，对外泌体蛋白进行化学发光检测时，在加入发光激发液之前使用二硫键解离试剂去除磁珠，然后进行外泌体蛋白的化学发光检测。

4、本发明中所述的蛋白抗体1、蛋白抗体2是指与目标蛋白免疫结合的两种不同表位的抗体，抗体不同，但是免疫结合的目标蛋白是同一个。

5、作为优选实施方案，所述方法包括如下步骤：

6、步骤1，对外泌体进行裂解，将裂解液与嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1进行孵育，得到复合物：嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1-目标蛋白；

7、步骤2，将步骤1中得到的复合物与蛋白抗体2-发光标记物进行偶联，得到偶联复合物：嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1-目标蛋白-蛋白抗体2-发光标记物；

8、步骤3，将步骤2中得到的偶联复合物采用二硫键解离试剂切掉二硫键，去除偶联复合物中的嗜硫磁珠，得到检测目标物；

9、步骤4，将步骤3中得到的检测目标物采用化学发光法进行检测，通过检测发光值实现对目标蛋白的检测。

10、作为优选实施方案，所述发光标记物为吖啶酯。

11、作为优选实施方案，所述目标蛋白为外泌体膜上和膜内都有表达的蛋白。

12、作为优选实施方案，所述目标蛋白为外泌体的her2蛋白、alk蛋白、pd-l1蛋白或cd9蛋白。

13、本发明还提供一种外泌体蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：抗体磁珠偶联试剂、化学发光偶联试剂、二硫键解离试剂、激发液；所述抗体磁珠偶联试剂包括嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1的复合物，所述化学发光偶联试剂包括蛋白抗体2-发光标记物的复合物；所述抗体磁珠偶联试剂中的复合物与样本中的目标蛋白结合，再与化学发光偶联试剂中的复合物结合形成偶联复合物，在加入激发液进行检测之前加入二硫键解离试剂去除检测液中的嗜硫磁珠。

14、作为优选实施方案，所述抗体磁珠偶联试剂的组成为：6.2-8.9g/ltris，4.75-7.63g/l氯化钠，0.25-0.81mg/ml嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-蛋白抗体1的复合物，其中蛋白抗体1的浓度为0.19-0.54μg/ml，ph:7.5-8.0，溶剂为水。

15、所述蛋白抗体1中的蛋白以her2蛋白为例，其组成优选为：7.6g/l的tris，6.8g/l的氯化钠，0.63mg/ml的her2磁珠偶联复合物(嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1的复合物)，其中her2抗体1的浓度为0.41μg/ml，ph:7.6，溶剂为水。

16、具体地，嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1的复合物的制备方法为：7.6g/l的tris，6.8g/l的氯化钠，0.19-0.54μg/ml的二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物，0.25-0.61mg/ml的嗜硫磁珠，4mg/ml的s-nhs，5mg/ml的edc充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育15min，制备获得her2磁珠偶联试剂。嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1的复合物优选为0.63mg/ml。其中的二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物为自行制备。

17、二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物制备过程如下：

18、二硫键长臂生物素-her2抗体1的制备：二硫键长臂生物素用无菌水配制成5g/l的溶液，将10μl二硫键长臂生物素溶液缓慢加入1ml(1mg/ml)her2抗体1中，室温下避光旋转反应1h。反应结束后，用1×pbs(ph:7.2)透析过夜，次日，换液继续透析5h。透析结束后，收集并分装，酶标仪定量蛋白。

19、作为优选实施方案，所述化学发光偶联试剂的组成为：2.8-6.7g/l磷酸二氢钠、1.5-4.3g/l磷酸氢二钠、3.2-8.4g/l氯化钠、0.03-0.47g/lf-127，0.54-0.87mg/ml蛋白抗体2-发光标记物，ph:6.0～6.8，溶剂为水。

20、所述蛋白抗体2-发光标记物中的蛋白以her2蛋白为例，其组成优选为：4.6g/l磷酸二氢钠、3.1g/l磷酸氢二钠、3.9g/l氯化钠、0.13g/lf-127，0.73mg/ml her2抗体2-ae偶联复合物，ph:6.5，溶剂为水。

21、具体地，her2抗体2-ae偶联试剂的制备方法为：(1)将her2抗体2用nahco3缓冲液溶解；优选的，nahco3缓冲液的ph:8.2-9.0；(2)加入7～13倍质量浓度吖啶酯(ae)；优选的，加入10倍质量浓度吖啶酯(ae)；(3)ph:7.0-7.5的缓冲液平衡脱盐纯化柱；用脱盐纯化柱过滤掉游离的吖啶酯。(4)过滤得到的her2抗体2-ae偶联复合物采用her2抗体2蛋白工作液缓冲液稀释。蛋白工作液缓冲液体系为：2.5-5.9g/l磷酸二氢钠、2.1-5.3g/l磷酸氢二钠、3.2-9.1g/l氯化钠、0.02-0.41g/lf-127，ph:6.0-6.8，溶剂为水；得到ph为6.0-6.8的her2抗体2-ae偶联试剂。her2抗体2-ae偶联复合物的浓度为0.54-0.87mg/ml，优选为0.73mg/ml。

22、作为优选实施方案，所述二硫键解离试剂的组成为：0.04m-0.22m tcep，9-19mm的dtt，溶剂为水。

23、进一步优选地，二硫键解离试剂的组成为：0.08m tcep，11.2mm的dtt，溶剂为水。

24、作为优选实施方案，所述激发液由激发液a和激发液b组成，所述激发液a的组成为：体积比0.03-0.4％的过氧化氢和0.2-0.5m的hno3，溶剂为水；所述激发液b的组成为：0.05-0.5m的氢氧化钠和0.1-1.0ml/l的tween-20，溶剂为水。

25、进一步优选地，所述激发液a的组成为：体积比0.15％的过氧化氢和0.32m的hno3，溶剂为水。所述激发液b的组成为：0.28m的氢氧化钠和0.55ml/l的tween-20，溶剂为水。

26、作为优选实施方案，所述检测试剂盒还包括：cd9磁珠偶联试剂、外泌体裂解液、洗涤试剂ⅰ、洗涤试剂ⅱ、洗涤试剂ⅲ、洗涤试剂ⅳ、pbst缓冲液、pbs缓冲液；其中，cd9磁珠偶联试剂的组成为：6.2-8.9g/l的tris，5.8-8.1g/l的氯化钠，0.4-0.6mg/ml的磁珠-cd9抗体偶联物，其中cd9抗体的浓度为0.2-0.4μg/ml，ph:7.5-8.0，溶剂为水；所述外泌体裂解液的组成为：2.5-5.0g/l的三羟甲基氨基甲烷，5.0-7.5g/l的氯化钠，体积百分比为0.6-6.5％的甘油，体积百分比为0.3-5％的np-40，0.02-0.5m的柠檬酸盐，溶剂为水；所述洗涤试剂ⅰ的组成为：5.5-9.5g/l的2-吗啉乙磺酸-水合物，溶剂为水；所述洗涤试剂ⅱ的组成为：6.5-9.5g/l的三羟甲基氨基甲烷，4.0-6.5g/l的氯化钠，0.1-0.6ml/l的tween-20，溶剂为水；所述洗涤试剂ⅲ的组成为：6.5-8.5g/l的三羟甲基氨基甲烷，5.0-7.5g/l的氯化钠，0.1-0.6ml/l的tween-20，溶剂为水；所述洗涤试剂ⅳ的组成为：7.2-9.5g/l的三羟甲基氨基甲烷，5.0-8.5g/l的氯化钠，溶剂为水。

27、优选地，所述外泌体裂解液的组成为：3.17g/l的三羟甲基氨基甲烷，6.01g/l的氯化钠，体积百分比为3.5％的甘油，体积百分比为1.25％的np-40，0.22m的柠檬酸盐，溶剂为水。

28、优选地，所述cd9磁珠偶联试剂的组成为：7.32g/l的tris，6.55g/l的氯化钠，0.51mg/ml的cd9抗体-磁珠偶联复合物；其中cd9抗体的浓度为0.32μg/ml，ph:7.8，溶剂为水。其中，cd9抗体-磁珠偶联复合物进一步优选为0.48mg/ml。

29、具体地，cd9磁珠偶联试剂制备方法为：7.63g/l的tris，6.7g/l的氯化钠，0.13-0.26μg/ml的cd9抗体，0.32-0.53mg/ml的磁珠，5mg/ml的s-nhs，6mg/ml的edc充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育15min，制备偶联试剂。

30、优选地，所述洗涤试剂ⅰ的组成为：6.83g/l的2-吗啉乙磺酸-水合物(mes)，溶剂为水。所述洗涤试剂ⅱ的组成为：7.95g/l的三羟甲基氨基甲烷(tris)，5.09g/l的氯化钠，0.25ml/l的tween-20，溶剂为水。所述洗涤试剂ⅲ的组成为：7.51g/l的三羟甲基氨基甲烷(tris)，6.43g/l的氯化钠，0.3ml/l的tween-20，溶剂为水。所述洗涤试剂ⅳ的组成为：8.14g/l的三羟甲基氨基甲烷(tris)，7.32g/l的氯化钠，溶剂为水。

31、具体地，以her2蛋白为例，利用本发明提供的试剂盒检测外泌体蛋白的方法，包括步骤如下：

32、(1)取30μl的cd9磁珠偶联试剂加入1ml 1×pbst(1×pbs，ph:7.2，加入5ml/l的tween-20)缓冲液吹打重悬，放置在磁力架上磁分离，待溶液澄清后去除液相。

33、(2)向(1)中加入200μl血浆和352μl的1×pbs缓冲液(ph:7.2)，37℃，孵育30min。

34、(3)向(2)中加入1ml 1×pbst(ph:7.2)缓冲液吹打重悬，放置在磁力架上磁分离，待溶液澄清后去除液相，再重复操作1遍(清洗2遍)。

35、(4)向(3)中加入200μl外泌体裂解液，吹打混匀，静置10min后放置在磁力架上磁分离5min，然后移取上清至新的离心管中。

36、(5)向离心管中加入10μl的her2磁珠偶联试剂(嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物)，吹打重悬，室温孵育20min。

37、所述her2磁珠偶联试剂(嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物)组分：7.6g/l的tris，6.8g/l的氯化钠，0.63mg/ml的嗜硫磁珠-二硫键长臂生物素-her2抗体1偶联复合物，其中her2抗体1的浓度为0.41μg/ml，ph:7.6，溶剂为水。

38、(6)向(5)加入1mlpbst(ph:7.2)缓冲液吹打重悬，放置在磁力架上磁分离，待溶液澄清后去除液相，再重复操作1遍(清洗2遍)。

39、(7)向(6)中加入250μl 1×pbst(ph:7.2)缓冲液，7μl的her2抗体2-ae偶联试剂吹打重悬，室温孵育20min。

40、所述her2抗体2-ae偶联试剂的组分为：4.6g/l磷酸二氢钠、3.1g/l磷酸氢二钠、3.9g/l氯化钠、0.13g/lf-127，0.73mg/ml her2抗体2-ae偶联复合物，ph:6.5，溶剂为水。

41、(8)向(7)加入1ml 1×pbst(ph:7.2)缓冲液吹打重悬，放置在磁力架上磁分离，待溶液澄清后去除液相，再重复操作1遍(清洗2遍)。

42、(9)向(8)加入250μl 1×pbst(ph:7.2)缓冲液吹打重悬。

43、(10)向(9)加入40μl二硫键解离试剂，吹打混匀后，静置2min，然后将离心管放置于磁力架上静置2min，将上清转移至新的离心管中。

44、(11)向(10)加入激发液a100μl，反应时间3min，再加入激发液b100μl，430nm波长检测外泌体总her2蛋白的发光值。

45、本发明中涉及的英文缩写注释如下：

46、her2：人类表皮生长因子受体2蛋白

47、alk：受体酪氨酸激酶

48、mes：2-吗啉乙磺酸-水合物

49、ae：吖啶酯

50、s-nhs：吖啶盐

51、edc：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺

52、tris：三羟甲基氨基甲烷

53、dtt：二硫苏糖醇

54、tcep：tris[2-羧乙基]盐酸膦

55、rlu：相对光单位

56、pbs：磷酸盐缓冲液

57、pbst：磷酸盐吐温缓冲液

58、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

59、1)本发明提出了一种新的外泌体总蛋白检测体系，尤其适用于在外泌体膜上和膜内都表达的蛋白，如her2蛋白和alk蛋白等。分离纯化外泌体后采用外泌体裂解试剂进行外泌体的充分裂解，释放目标蛋白。使用嗜硫磁珠作为载体之一，与带有二硫键长臂生物素的her2抗体1复合物进行偶联，得到的偶联复合物与裂解的血浆外泌体溶液进行孵育，然后利用夹心法再连接her2抗体2-ae。在进行化学发光检测前使用二硫键解离试剂切掉二硫键，进而去掉嗜硫磁珠，再进行化学发光检测。本发明提供的检测方法使外泌体既能充分裂解、高效进行抗体抗原反应，同时不影响后续化学发光检测。

60、2)本发明筛选出了适合外泌体总目标蛋白检测所使用的嗜硫磁珠、偶联抗体的比例、偶联辅助剂等配方，能够比较灵敏的检测出血浆外泌体总her2蛋白表达量。。

61、3)本发明检测试剂盒由于使用了可以固定的磁珠体系，可以自动转移和固定待测样本，可以实现自动化操作，并实现多样本同时进行检测，使检测灵敏、高效、且节约人力成本和时间成本。