一种防治家禽传染性鼻炎中药制剂指纹图谱的检测方法与流程

1.本发明属于药物检测技术领域，尤其涉及一种基于谱效关系的防治家禽传染性鼻炎中药制剂指纹图谱的检测方法。
技术背景
2.防治家禽传染性鼻炎中药制剂由炒苍耳子、车前草、辛夷、白芷、密蒙花等药材组合而成。炒苍耳子为菊科植物苍耳的干燥成熟带总苞的果实，照清炒法炒至黄褐色而成，以绿原酸、苍耳苷等为主要化学成分，具有散风湿，通鼻窍，解疮毒的功效；车前草为车前科植物车前或平车前的干燥全草，以大车钱苷、木兰脂素等为主要活性成分，具有清热利尿，凉血解毒的功效；辛夷为木兰科植物望春花、玉兰或武当玉兰的干燥花蕾，以挥发油、木兰脂素、黄酮类为主要活性成分，具有抗炎抗过敏、中枢抑制等作用，具有散风寒，通鼻窍的功效；白芷为伞形科植物杭白芷、川白芷的根，其中含有挥发油和香豆素类如欧前胡素、异欧前胡素等有效成分，具有解热、抗炎整体、松弛平滑肌的作用，主治感冒、鼻塞等症；密蒙花为马钱科醉鱼草属植物密蒙花的花蕾和花序，以黄酮类如蒙花苷、密蒙花新苷和环烯醚萜苷类如桃叶珊瑚苷等为主要活性成分，具有保肝、抗炎抗菌、解痉、抗氧化等功效。再与其他重要组合使用，可有效防治家禽传染性鼻炎，缓解传染性鼻炎引发的各类症状。由于中药材种类众多，如何建立简单有效的质量监控技术，保证防治家禽传染性鼻炎的中药制剂的一致性，对防治家禽传染性鼻炎的中药制剂的质量控制具有重要的意义。
3.中药指纹图谱作为中药质量控制的关键技术，能够全面的反映出中药材中各种不同化学成分浓度分布的整体状况，是中药整体质量控制手段，中药生产工艺的改进和规范中药成品的质量控制产生深远的影响。另一方面，中药指纹图谱作为一种综合的、可量化的鉴别手段，在现阶段，通过指纹特征相似程度的比较，判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性，是一种符合中药特色的质量控制模式之一。
4.目前，由于防治家禽传染性鼻炎中药制剂的组方独特，组成较为复杂，如果进行单一成分的定量检测，在质量控制方面增加检测成本及人员、时间等成本；且本方为独特组方，此前未曾有关于本方的谱效关系方面的研究，因此，对防治家禽传染性鼻炎中药制剂质量控制的研究方法有待进一步探索。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明提供了一种防治家禽传染性鼻炎中药制剂指纹图谱的检测方法，所述中药制剂中的中药组分包含炒苍耳子、车前草、辛夷、白芷、密蒙花。本发明提供的hplc指纹图谱的检测方法可有效的同时定量检测绿原酸、蒙花苷、木犀草素、木兰脂素和欧前胡素；本发明检测方法具有方法简便、客观性强等优点，有利于对防治家禽传染性鼻炎中药制剂进行质量检测。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明第一方面，提供了一种防治家禽传染性鼻炎中药制剂指纹图谱的检测方
法，检测方法包括以下步骤：
8.(1)对照品溶液的制备：分别称取绿原酸、蒙花苷、木犀草素、木兰脂素和欧前胡素对照品，用甲醇分别稀释制得储备液；将各储备液混合制得对照品溶液；
9.(2)供试品溶液的制备：精密称取防治家禽传染性鼻炎中药制剂，加入50％甲醇/水溶液，称重，超声，放至室温，再称重，补足减失重量，过滤，即得；
10.(3)分析检测：采用高效液相hplc色谱-紫外检测进行分析；
11.(4)建立指纹图谱：提取特征色谱峰。
12.进一步地，步骤(1)中对照品溶液的制备为取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含绿原酸500μg的储备液；取蒙花苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含蒙花苷1000μg的储备液；取木犀草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含木犀草素1000μg的储备液；取木兰脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含木兰脂素1000μg的储备液；取欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含欧前胡素100μg的储备液。
13.混合对照品的制备：将各储备液混合，以甲醇稀释为绿原酸浓度50μg/ml、蒙花苷浓度100μg/ml、木犀草素浓度100μg/ml、木兰脂素浓度100μg/ml、欧前胡素浓度10μg/ml的混合对照品溶液。
14.进一步，步骤(2)中供试品溶液的制备，优选为，精密称取防治家禽传染性鼻炎中药制剂2g置于具塞锥形瓶中，加25ml 50％甲醇/水，称定重量，超声处理30min，放置至室温，再称定重量，50％甲醇/水补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
15.步骤(3)中所述hplc色谱条件为：色谱柱为supfex jx-c18，5μm，4.6
×
250mm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为250nm；以纯乙腈为流动相a，0.1％甲酸/水为流动相b，进行梯度洗脱。
16.优选地，洗脱条件为：0～35min，8％～15％a；35～75min，15％～30％a；75～110min，30％～40％a；110～150min，40％～60％a；150～155min，60％～40％a。
17.含量检测对绿原酸、蒙花苷、木犀草素、木兰脂素和欧前胡素均采用外标定量法进行定量检测。
18.步骤(4)中提取特征色谱峰的保留时间分别为：绿原酸20.843～20.966min、蒙花苷73.046～73.294min、木犀草素76.478～76.691min、木兰脂素115.218～115.453min、欧前胡素134.786～134.910min。
19.本发明第二方面，基于上述防治家禽传染性鼻炎中药制剂的hplc指纹图谱检测方法，本发明还提供了一种基于谱效关系的防治家禽传染性鼻炎中药制剂的质量检测方法，包括以下步骤：
20.(1)建立防治家禽传染性鼻炎中药制剂的hplc指纹图谱检测方法；
21.(2)测定防治家禽传染性鼻炎中药制剂的抗炎活性；
22.(3)将步骤(1)所识别特征峰的峰面积和步骤(2)所得的抗炎活性进行灰色关联度分析，并计算各特征峰与抗炎活性之间的关联度，评价特征峰的抗炎活性。
23.在本发明中，进行了10批防治家禽传染性鼻炎中药制剂的hplc指纹图谱相似度评价。
24.本发明通过建立防治家禽传染性鼻炎中药制剂的hplc指纹图谱得到共有特征峰；
通过建立细胞抗炎模型测定防治家禽传染性鼻炎中药制剂的抗炎因子指标；再根据hplc指纹图谱特征峰的峰面积和抗炎指标建立灰色关联度分析，并利用所建立的灰色关联度分析方法来评价特征峰与抗炎活性的关联度大小。
25.步骤(2)中所述测定防治家禽传染性鼻炎中药制剂的抗炎活性步骤如下：
26.1)预防抗炎试验：将raw264.7细胞密接于96孔板，24h后加入防治家禽传染性鼻炎中药制剂的样品溶液培养，培养6h后弃去含药培养基，加入lps诱导细胞炎症，诱导24h后，测定细胞上清液中no释放量及il-6和tnf-α水平。
27.2)直接抗炎试验：将raw264.7细胞密接于96孔板，24h后加入lps诱导细胞炎症，同时将防治家禽传染性鼻炎中药制剂的样品溶液加入细胞中，作用24h后，测定细胞上清液中no释放量及il-6和tnf-α水平。
28.灰色关联度分析步骤如下：
29.1)将各样品的抗炎活性指标组成参考数列，将各样品指纹图谱中的各特征峰峰面积组成比较数列；
30.2)对步骤1)中的参考数列和比较数列采用均值化方法进行无量纲化处理；
31.3)根据步骤2)所得无量纲化处理的参考数列和比较数列，计算各特征峰与抗炎活性之间的关联度；
32.4)对步骤3)所得关联度进行排序，评价特征峰的抗炎活性。
33.本发明中，关联度的计算方法为：
34.采用下方公式计算关联度系数：
[0035][0036]
其中，x0(k)表示参考数列，xi(k)表示比较数列，ρ为分辨系数，ρ值取0.5；
[0037]
然后再按照下发公式计算关联度：
[0038][0039]
均值化方法，通常是指将每一变量值除以该变量的平均值。该方法在消除量纲和数量级影响的同时，保留了个变量取值差异程度上的信息，也保留了数据的可比性。
[0040]
本发明的有益之处在于：
[0041]
1.采用的防治家禽传染性鼻炎中药制剂hplc指纹图谱可以通过色谱峰的保留时间对共有特征峰进行识别，从而保证了特征峰识别的准确性和重复性；可直接通过防治家禽传染性鼻炎中药制剂hplc指纹图谱预测其抗炎活性，对防治家禽传染性鼻炎中药制剂的质量进行评价；且采用hplc指纹图谱与数学模型结合的方法可避免人为因素造成峰干扰。
[0042]
2.基于高效液相色谱-紫外检测技术建立了单波长指纹图谱质量控制办法，在一次分析中同时实现指纹图谱分析和多指标成分包括绿原酸、蒙花苷、木犀草素、木兰脂素和欧前胡素的定量检测，能够更加全面、准确地评价防治家禽传染性鼻炎中药制剂的质量，实现对防治家禽传染性鼻炎中药制剂的全面控制，同时最大程度缩短了检测时间，较少了资源的耗费。
[0043]
3.通过采用本发明的方法，得知防治家禽传染性鼻炎中药制剂中蒙花苷、木兰脂素和欧前胡素与预防抗炎效果中降低no释放量和tnf-α水平关联度高，蒙花苷和欧前胡素与预防抗炎效果中降低il-6水平关联度高；绿原酸、蒙花苷和木兰脂素与直接抗炎效果中降低no释放量关联度高，绿原酸与直接抗炎效果中降低il-6水平关联度高，蒙花苷、绿原酸和和欧前胡素与直接抗炎效果中tnf-α水平关联度高。本发明具有方法简便，客观性强等优点，有利于对防治家禽传染性鼻炎中药制剂进行质量控制。
附图说明
[0044]
图1为10批防治家禽传染性鼻炎中药制剂(s1-s10)的hplc指纹图谱；
[0045]
图2为防治家禽传染性鼻炎中药制剂的hplc指纹图谱对照图谱；
[0046]
图3为预防炎症试验中样品(s1-s10)对no释放量测定结果；
[0047]
图4为预防炎症试验中样品(s1-s10)对il-6水平测定结果；
[0048]
图5为预防炎症试验中样品(s1-s10)对tnf-α水平测定结果；
[0049]
图6为直接抗炎试验中样品(s1-s10)对no释放量测定结果；
[0050]
图7为直接抗炎试验中样品(s1-s10)对il-6水平测定结果；
[0051]
图8为直接抗炎试验中样品(s1-s10)对tnf-α水平测定结果。
具体实施方式
[0052]
下面结合实例，对本发明的技术方案进行进一步解释和说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
[0053]
本试验在具体实施例中可采用的试验材料和仪器的相关信息如下：
[0054]
仪器：waters alliance高效液相色谱仪(2695梯度泵，waters 2487紫外检测器，自动进样器，柱恒温系统，empower色谱工作站)、synergy htx多功能微孔板检测仪(美国biotek，紫外/可见吸收光)。
[0055]
试剂：乙腈(色谱纯，sigma-aldrich)，甲醇(色谱纯，sigma-aldrich)，实验水为mil-q纯水系统生成，其余试剂均为分析纯；lps(biosharp)，dmem(gibco)，胎牛血清(四季青)；pbs 10
×
(biosharp)。
[0056]
对照品：供含量测定绿原酸(含量：99.3％；批号：110753-201716，中国食品药品检定所，供含测用)；蒙花苷(含量：95.9％；批号：111528-200605，中国食品药品检定所，供含测用)；木犀草素(含量：96.3％；批号：111520-202107，中国食品药品检定所，供含测用)；木兰脂素(含量：98.3％；批号：110882-201206，中国食品药品检定研究院，供含测用)，欧前胡素(含量：99.9％；批号：110826-200511，中国食品药品检定所，供含测用)。
[0057]
细胞株：raw264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，由天津中医药大学惠赠。
[0058]
试剂盒：no检测试剂盒、小鼠白细胞介素6(il-6)elisa试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子α(tnf-α)elisa试剂盒。
[0059]
实施例1防治家禽传染性鼻炎中药制剂hplc指纹图谱的建立
[0060]
实施方法
[0061]
1.分析条件
[0062]
仪器：watersalliance高效液相色谱仪；
[0063]
色谱柱：supfex jx-c18(250*4.6mm，5μm)；
[0064]
流速：1.0ml/min；
[0065]
柱温：30℃；
[0066]
进样量：20μl；
[0067]
波长采集范围：190nm～600nm；
[0068]
波长：250nm；
[0069]
流动相：a.乙腈：b.0.1％甲酸/水(v/v)；
[0070]
梯度：
[0071]
时间(min)乙腈/％(a)0.1％甲酸/％(b)0～358
→
1592
→
8535～7515
→
3085
→
7075～11030
→
4070
→
60110～15040
→
6060
→
40150～15560
→
4040
→
60
[0072]
2.对照品的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含绿原酸500μg的储备液；取蒙花苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含蒙花苷1000μg的储备液；取木犀草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含木犀草素1000μg的储备液；取木兰脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含木兰脂素1000μg的储备液；取欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含欧前胡素100μg的储备液。以上各储备液以甲醇稀释为绿原酸浓度50μg/ml、蒙花苷浓度100μg/ml、木兰脂素浓度100μg/ml、欧前胡素浓度10μg/ml、异欧前胡素浓度10μg/ml的混合对照品溶液。
[0073]
3.供试品溶液的制备：精密称取防治家禽传染性鼻炎中药制剂2g置于具塞锥形瓶中，加25ml 50％甲醇/水，称定重量，超声处理30min，放置至室温，再称定重量，50％甲醇/水补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
[0074]
4.结果：经测定，该供试品中含绿原酸14.88mg/ml、蒙花苷2.78mg/ml、木犀草素0.11mg/ml、木兰脂素3.50mg/ml、欧前胡素0.27mg/ml。
[0075]
实施例2方法学验证
[0076]
1.仪器精密度验证
[0077]
依照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备一份供试品溶液连续进样六次。以木犀草素(峰3)为参照峰，考察特征峰(峰1：绿原酸；峰2：蒙花苷；峰3：木犀草素；峰4：木兰脂素；峰5：欧前胡素)与参照峰的相对保留时间(表1)和相对峰面积值(表2)。
[0078]
结果表明，防治家禽传染性鼻炎中药制剂同一供试品连续进样六针，各特征峰相对保留时间的rsd为0.029％～0.191％之间，相对峰面积的rsd为0.415％～0.940％之间，表明所用仪器精密度良好。
[0079]
表1相对保留时间rsd(精密度考察)
[0080]
样品号峰1峰2峰3峰4峰513.6571.0461.0000.6640.56823.6571.0461.0000.6640.56833.6681.0461.0000.6640.569
43.6641.0461.0000.6640.56953.6531.0471.0000.6640.56763.6711.0461.0000.6640.568average3.6621.0461.0000.6640.568sd0.0070.0000.0000.0000.000rsd0.191％0.029％0.000％0.035％0.079％
[0081]
表2相对峰面积rsd(精密度考察)
[0082]
样品号峰1峰2峰3峰4峰510.0930.1361.0000.2560.11720.0920.1341.0000.2560.11530.0930.1361.0000.2550.11740.0920.1341.0000.2540.11550.0920.1351.0000.2540.11560.0930.1341.0000.2540.117average0.0920.2351.0000.2550.116sd0.0010.0010.0000.0010.001rsd0.737％0.692％0.000％0.415％0.940％
[0083]
2.重复性验证
[0084]
依照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备六分供试品溶液进行分析，以木犀草素(峰3)为参照峰，考察特征峰(峰1：绿原酸；峰2：蒙花苷；峰3：木犀草素；峰4：木兰脂素；峰5：欧前胡素)与参照峰的相对保留时间(表3)和相对峰面积值(表4)。
[0085]
结果表明，防治家禽传染性鼻炎中药制剂同一供试品连续进样六针，各特征峰相对保留时间的rsd为0.050％～0.545％之间，相对峰面积的rsd为0.389％～0.883％之间，表明本方法重复性良好。
[0086]
表3相对保留时间rsd(重复性考察)
[0087]
样品号峰1峰2峰3峰4峰513.6771.0461.0000.6640.56823.6691.0471.0000.6640.56833.6731.0471.0000.6640.56843.6591.0471.0000.6640.56853.6711.0611.0000.6640.56863.6681.0461.0000.6650.569average3.6691.0491.0000.6640.568sd0.0060.0060.0000.0000.000rsd0.166％0.545％0.000％0.050％0.060％
[0088]
表4相对峰面积rsd(重复性考察)
[0089]
样品号峰1峰2峰3峰4峰510.0950.1411.0000.2810.126
20.0950.1441.0000.2860.12530.0950.1431.0000.2860.12640.0950.1421.0000.2830.12750.0950.1411.0000.2810.12760.0950.1411.0000.2810.128average0.0950.1421.0000.2830.126sd0.0000.0010.0000.0020.001rsd0.389％0.740％0.000％0.883％0.705％
[0090]
3.稳定性验证
[0091]
依照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备一份供试品溶液，分别在0h、4h、8h、12h、18h、24h进行分析，以木犀草素(峰3)为参照峰，考察特征峰(峰1：绿原酸；峰2：蒙花苷；峰3：木犀草素；峰4：木兰脂素；峰5：欧前胡素)与参照峰的相对保留时间(表5)和相对峰面积值(表6)。
[0092]
结果表明，各特征峰相对保留时间的rsd为0.037％～0.550％之间，相对峰面积的rsd为0.444％～0.726％之间，表明24h内供试品溶液稳定性良好。
[0093]
表5相对保留时间rsd(稳定性考察)
[0094]
样品号峰1峰2峰3峰4峰50h3.6571.0461.0000.6640.5684h3.6681.0461.0000.6640.5698h3.6771.0461.0000.6640.56812h3.6711.0611.0000.6640.56818h3.6731.0471.0000.6640.56824h3.6531.0471.0000.6640.567average3.6671.0491.0000.6640.568sd0.0090.0060.0000.0000.000rsd0.252％0.550％0.000％0.037％0.081％
[0095]
表6相对峰面积rsd(稳定性考察)
[0096]
样品号峰1峰2峰3峰4峰50h0.0930.1361.0000.2560.1174h0.0930.1361.0000.2550.1178h0.0930.1361.0000.2560.11712h0.0930.1351.0000.2570.11618h0.0930.1351.0000.2560.11724h0.0920.1351.0000.2540.115average0.0930.1361.0000.2560.117sd0.0010.0010.0000.0010.001rsd0.726％0.458％0.000％0.444％0.695％
[0097]
4.经本试验中各项验证，本发明建立的hplc指纹图谱方法可靠。
[0098]
实施例3hplc指纹图谱定量检测
[0099]
1.仪器精密度
[0100]
按照实施例1样品制备方法及色谱条件，制备一份供试品溶液连续进行六次分析。结果显示，绿原酸含量的rsd为0.888％、蒙花苷含量的rsd为0.682％、木犀草素含量的rsd为0.544％、木兰脂素含量的rsd为0.304％、欧前胡素含量的rsd为0.812％，rsd＜3％，表明所用仪器对防治家禽传染性鼻炎中药制剂供试品溶液定量检测的精密度良好。
[0101]
表7绿原酸、蒙花苷、木犀草素、木兰脂素、欧前胡素含量rsd(精密度考察)
[0102]
样品号峰1峰2峰3峰4峰5114.8772.7120.1023.4280.267214.6872.6920.1033.4160.264314.8642.7290.1033.4080.270414.6172.6950.1033.4320.266514.5702.7290.1023.4090.267614.8102.7360.1023.4090.267average14.7372.7160.1023.4170.267sd0.1310.0190.0010.0100.002rsd0.888％0.682％0.544％0.304％0.812％
[0103]
2.重复性
[0104]
按照实施例1方法制备方法及色谱条件，制备六份供试品溶液进行分析。结果显示，绿原酸含量rsd为0.481％、蒙花苷含量的rsd为0.286％、木犀草素含量的rsd为0.477％、木兰脂素含量的rsd为0.319％、欧前胡素含量的rsd为0.556％，rsd＜3％，表明本方法对防治家禽传染性鼻炎中药制剂供试品溶液定量检测的重复性较好。
[0105]
表8绿原酸、蒙花苷、木犀草素、木兰脂素、欧前胡素含量rsd(重复性考察)
[0106]
样品号峰1峰2峰3峰4峰5114.9772.7520.1023.4280.271214.9642.7590.1033.4080.270314.9102.7660.1023.4090.271415.0892.7700.1033.4280.272515.0822.7630.1022.4340.274615.0472.7750.1023.4280.273average15.0113.7640.1023.4220.272sd0.0720.0080.0000.0110.002rsd0.481％0.286％0.477％0.319％0.556％
[0107]
3.稳定性
[0108]
按照实施例1方法制备方法及色谱条件，制备一份供试品溶液进行分析。分别统计0h、4h、8h、12h、18h、24h的色谱分析结果。结果显示，绿原酸含量rsd为0.647％、蒙花苷含量的rsd为1.346％、木犀草素含量的rsd为1.181％、木兰脂素含量的rsd为1.669％，欧前胡素含量的rsd为1.245％，rsd＜3％，表明防治家禽传染性鼻炎中药制剂供试品溶液在24h内主要指标成分含量稳定。
[0109]
表9绿原酸、蒙花苷、木犀草素、木兰脂素、欧前胡素含量rsd(稳定性考察)
[0110]
样品号峰1峰2峰3峰4峰50h15.0872.7720.1083.4980.2744h15.2472.7750.1103.5880.2798h15.1822.7630.1093.5340.27412h15.2862.8110.1103.4910.24618h15.2262.8610.1073.5880.27924h15.3802.8230.1093.6420.283average15.2352.8010.1093.5570.278sd0.0990.0380.010.0590.003rsd0.647％1.346％1.181％1.669％1.245％
[0111]
实施例4 10批相同厂家防治家禽传染性鼻炎中药制剂的hplc指纹图谱检测
[0112]
实施方法
[0113]
采用实施例3建立的定量指纹谱方法，对10批次相同厂家防治家禽传染性鼻炎中药制剂进行指纹图谱分析，记录色谱图，将色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行色谱峰匹配(中药指纹图谱相似度评价系统2012.0版本)，见图1，对照图谱见图2。
[0114]
经相似度计算结果显示，10批相同厂家防治家禽传染性鼻炎中药制剂相似度均大于0.999，见表10。
[0115]
表10 10批次相同厂家防治家禽传染性鼻炎中药制剂相似度评价结果
[0116]
序号s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10相似度0.9990.9990.9990.9990.9990.9990.9990.9990.9990.999
[0117]
实施例5 10批不同含量防治家禽传染性鼻炎中药制剂定量检测
[0118]
实施方法
[0119]
采用经实施例3验证后的hplc指纹图谱定量检测方法，对10批次不同含量防治家禽传染性鼻炎中药制剂进行定量检测，定量检测结果见表11，特征峰保留时间见表12。
[0120]
表11 10批次不同含量防治家禽传染性鼻炎中药制剂定量检测结果
[0121][0122]
表12 10批次不同含量防治家禽传染性鼻炎中药制剂特征峰保留时间
[0123][0124]
结果表明，本方法可对不同含量防治家禽传染性鼻炎中药制剂有效成分含量进行定量检测。
[0125]
实施例6体外预防炎症试验
[0126]
1.实施方法
[0127]
1)样品溶液的配制
[0128]
按防治家禽传染性鼻炎中药制剂生药量折算，配制成1mg/ml样品溶液。
[0129]
2)预防炎症模型的建立及给药方案
[0130]
将raw264.7细胞以1
×
105/ml密度接种于96孔板，24h后分组处理，给药组加入1.0mg/ml的10批样品溶液处理，6h后弃去含药培养基，加入无血清的dmem完全培养基培养，模型组及给药组加入2μg/ml的lps，放置于5％co2、37℃培养箱中诱导24h。
[0131]
3)各抗炎活性指标的测定
[0132]
a)no释放量试验
[0133]
给药结束后取细胞上清液，按照no检测试剂盒检测给药组和空白组、模型组中no的释放量。
[0134]
b)il-6水平试验
[0135]
给药结束后取细胞上清液，按照il-6检测试剂盒检测给药组和空白组、模型组中il-6的水平变化。
[0136]
c)tnf-α水平试验
[0137]
给药结束后取细胞上清液，按照tnf-α检测试剂盒检测给药组和空白组、模型组中tnf-α的水平变化。
[0138]
2.试验结果
[0139]
1)no释放量测定结果
[0140]
试验结果表明：与空白组相比，经lps诱导的raw264.7细胞，细胞上清液中no的释放量显著升高，具有极显著差异，p＜0.01，表明造模成功。与lps模型组相比，各给药组中no的释放量均出现显著降低，各给药组均具有极显著差异，p＜0.01。结果见表13。
[0141]
表13 no释放量测定结果
[0142][0143][0144]
注：与空白组相比，
**
代表差异极显著(p＜0.01)；与模型组相比，
##
代表差异极显著(p＜0.01)，
#
代表差异显著(0.01＜p＜0.05)
[0145]
2)il-6水平测定结果
[0146]
试验结果表明：与空白组比较，经lps诱导的raw264.7细胞，细胞上清液中il-6水平显著升高，具有极显著差异，p＜0.01，表明造模成功。与lps模型组比较，各药物组中il-6水平均均出现显著降低，各给药组均具有极显著差异p＜0.01。结果见表14。
[0147]
表14il-6水平测定结果
[0148]
组别il-6(pg/ml)空白组28.81
±
1.11lps模型组52.62
±
0.74
**
s142.22
±
0.29
##
s246.52
±
0.16
##
s342.77
±
1.47
##
s442.84
±
0.78
##
s541.35
±
0.96
##
s645.49
±
0.50
##
s744.20
±
0.33
##
s842.54
±
0.77
##
s943.48
±
0.33
##
s1043.46
±
1.25
##
[0149]
注：与空白组相比，
**
代表差异极显著(p＜0.01)；与模型组相比，
##
代表差异极显著(p＜0.01)，
#
代表差异显著(0.01＜p＜0.05)
[0150]
3)tnf-α水平测定结果
[0151]
试验结果表明：与空白组相比，经lps诱导的raw264.7细胞，细胞上清液中tnf-α水平显著升高，具有极显著差异，p＜0.01，表明造模成功。与lps模型组相比，各给药组中tnf-α水平均出现不同程度降低，s2-s4、s8、s9组具有极显著差异，p＜0.01；其余各给药组具有
显著差异，0.01＜p＜0.05。
[0152]
表15tnf-α水平测定结果
[0153][0154][0155]
注：与空白组相比，
**
代表差异极显著(p＜0.01)；与模型组相比，
##
代表差异极显著(p＜0.01)，
#
代表差异显著(0.01＜p＜0.05)
[0156]
经测定细胞上清液中no释放量和il-6、tnf-α的抗炎水平，本实施例中细胞炎症模型建立成功，空白组、给药组均与模型组的差异具有统计学意义。
[0157]
实施例7体外直接抗炎试验
[0158]
1.实施方法：
[0159]
1)样品溶液的配制：
[0160]
按防治鸡家禽传染性鼻炎产品中药制剂生药量折算，配制成1mg/ml样品溶液。
[0161]
2)直接抗炎模型的建立及给药方案
[0162]
将处于对数生长期的raw264.7细胞以1
×
105/ml密度接种于96孔板中，24h后分组处理，空白组加入无血清的dmem完全培养基培养，模型组加入浓度为加入2μg/ml的lps，给药组同时加入2μg/ml的lps和1.0mg/ml的10批样品溶液，放置于5％co2、37℃培养箱中诱导24h。
[0163]
3)各抗炎指标的测定
[0164]
a)no释放量试验
[0165]
给药结束后取细胞上清液，按照no检测试剂盒检测给药组和空白组、模型组中no的释放量。
[0166]
b)il-6水平试验
[0167]
给药结束后取细胞上清液，按照il-6检测试剂盒检测给药组和空白组、模型组中il-6的水平变化。
[0168]
c)tnf-α水平试验
[0169]
给药结束后取细胞上清液，按照tnf-α检测试剂盒检测给药组和空白组、模型组中tnf-α的水平变化。
[0170]
2.试验结果
[0171]
1)no释放量测定结果
[0172]
试验结果表明：与空白组相比，经lps诱导的raw264.7细胞，细胞上清液中no的释放量显著升高，具有极显著差异，p＜0.01，表明造模成功。与lps模型组相比，各给药组no的释放量均出现不同程度降低，s1-s6、s8、s10组具有极显著差异，p＜0.01；s7、s9组具有显著差异，0.01＜p＜0.05。结果见16。
[0173]
表16no释放量测定结果
[0174]
组别no(μmol/ml)空白组5.90
±
0.15lps模型组32.48
±
2.02
**
s121.60
±
0.20
##
s222.53
±
0.25
##
s326.37
±
0.61
##
s426.64
±
0.11
##
s524.61
±
0.15
##
s627.23
±
0.45
##
s729.32
±
0.16
#
s827.40
±
0.80
##
s929.37
±
0.82
#
s1027.01
±
0.59
##
[0175]
注：与空白组相比，
**
代表差异极显著(p＜0.01)；与模型组相比，
##
代表差异极显著(p＜0.01)
[0176]
2)il-6水平测定结果
[0177]
试验结果表明：与空白组相比，经lps诱导的raw264.7细胞，细胞上清液中il-6水平显著升高，具有极显著差异，p＜0.01，表明造模成功。与lps模型组相比，各给药组中il-6水平均出现显著降低，各给药组均具有极显著差异，p＜0.01。结果见表17。
[0178]
表17il-6水平测定结果
[0179]
组别il-6(pg/ml)空白组35.45
±
0.45lps模型组51.49
±
2.10
**
s132.50
±
0.63
##
s230.95
±
0.85
##
s340.45
±
0.23
##
s435.14
±
1.35
##
s533.25
±
0.30
##
s638.79
±
1.35
##
s735.46
±
0.58
##
s834.23
±
1.55
##
s938.20
±
0.77
##
s1037.62
±
1.15
##
[0180]
注：与空白组相比，
**
代表差异极显著(p＜0.01)；与模型组相比，
##
代表差异极显著(p＜0.01)，
#
代表差异显著(0.01＜p＜0.05)
[0181]
3)tnf-α水平测定结果
[0182]
试验结果表明：与空白组相比，经lps诱导的raw264.7细胞，细胞上清液中tnf-α水平显著升高，具有极显著差异，p＜0.01，表明造模成功。与lps模型组相比，各给药组中tnf-α水平均出现显著降低，各给药组均具有极显著差异，p＜0.01。结果见表18。
[0183]
表18tnf-α水平测定结果
[0184]
组别tnf-α(pg/ml)空白组146.67
±
0.53lps模型组254.37
±
0.75
**
s1176.87
±
0.40
##
s2165.48
±
0.79
##
s3181.54
±
0.41
##
s4168.80
±
0.44
##
s5175.48
±
1.24
##
s6163.86
±
0.61
##
s7189.92
±
0.95
##
s8179.54
±
0.25
##
s9174.34
±
0.45
##
s10176.74
±
1.15
##
[0185]
注：与空白组相比，
**
代表差异极显著(p＜0.01)；与模型组相比，
##
代表差异极显著(p＜0.01)，
#
代表差异显著(0.01＜p＜0.05)
[0186]
经测定细胞上清液中no释放量和il-6、tnf-α的抗炎水平，本实施例中细胞炎症模型建立成功，空白组、给药组均与模型组的差异具有统计学意义。
[0187]
实施例8谱效关系分析
[0188]
本实施例采用灰色关联度分析的方法，揭示多个自变量与一个因变量之间的关系，关联度的大小用于判别变量对指标影响的大小。特征峰面积的无量纲化结果见表19，抗炎活性的无量纲化结果见表20。
[0189]
表19 10批样品指纹图谱特征峰面积的无量纲化处理结果
[0190]
[0191][0192]
表20 10批样品抗炎活性的无量纲化处理结果
[0193][0194]
1.实施方法
[0195]
(1)灰色关联分析
[0196]
灰色关联分析的基本步骤包括：
[0197]
1)以各样品的抗炎活性指标组成参考数列，以各样品指纹图谱中的特征峰峰面积组成比较数列；
[0198]
2)对参考数列和比较数列进行无量纲化处理；采用均值化方法进行处理；
[0199]
3)根据无量纲化的参考数列和比较数列，计算各特征峰与抗炎活性之间的关联度；
[0200]
4)对步骤3)所得关联度进行排序。
[0201]
在计算关联度过程中，可按照下方公式计算关联系数：
[0202][0203]
其中，x0(k)表示参考数列，xi(k)表示比较数列，ρ为分辨系数，通常取0.5。
[0204]
然后再按照下面公式计算关联度：
[0205][0206]
所述均值化方法，通常是指将每一变量值除以该变量的平均值。该方法在消除量纲和数量级影响的同时，保留了个变量取值差异程度上的信息，也保留了数据的可比性。
[0207]
2.试验结果
[0208]
1)预防炎症试验
[0209]
a)no释放量
[0210]
进行灰色关联度分析
[0211]
从表21可得，各自变量所代表的化学物质与降低no释放量之间的关联度排序如下：蒙花苷＞欧前胡素＞木兰脂素＞绿原酸＞木犀草素
[0212]
其中蒙花苷与降低no释放量之间的关联度最大，提示蒙花苷与降低no释放量的关系最为密切。
[0213]
关联度大于0.7所对应的峰(欧前胡素、木兰脂素)对降低no释放量也起着一定的协同作用。
[0214]
表21降低no释放量灰色关联度分析结果
[0215]
色谱峰tr/min关联度绿原酸20.9660.6996蒙花苷73.2880.7249木犀草素76.6790.6749木兰脂素115.4180.7105欧前胡素134.8810.7158
[0216]
b)il-6水平
[0217]
进行灰色关联度分析
[0218]
从表22可得，各自变量所代表的化学物质与降低il-6水平之间的关联度排序如下：蒙花苷＞欧前胡素＞木兰脂素＞木犀草素＞绿原酸
[0219]
其中蒙花苷与降低il-6水平之间的关联度最大，提示蒙花苷与降低il-6水平的关系最为密切。
[0220]
关联度大于0.7所对应的峰(欧前胡素)对降低il-6水平也起着一定的协同作用。
[0221]
表22降低il-6水平关联度分析结果
[0222]
色谱峰tr/min关联度绿原酸20.9470.6252蒙花苷73.2330.7087木犀草素76.6120.6835木兰脂素115.3700.6849欧前胡素134.8790.7009
[0223]
c)tnf-α水平
[0224]
进行灰色关联度分析
[0225]
从表23可得，各自变量所代表的化学物质与降低tnf-α水平之间的关联度排序如下：欧前胡素＞蒙花苷＞木兰脂素＞绿原酸＞木犀草素
[0226]
其中欧前胡素与降低tnf-α水平之间的关联度最大，提示欧前胡素与降低tnf-α水平的关系最为密切。
[0227]
关联度大于0.7所对应的峰(蒙花苷、木兰脂素)对降低tnf-α水平也起着一定的协同作用。
[0228]
表23降低tnf-α水平关联度分析结果
[0229]
色谱峰tr/min关联度绿原酸20.9080.6710蒙花苷73.2940.7459木犀草素76.6910.6364木兰脂素115.4530.7031欧前胡素134.8560.7796
[0230]
2)直接抗炎试验
[0231]
a)no释放量
[0232]
进行灰色关联度分析
[0233]
从表24可得，各自变量所代表的化学物质与降低no释放量之间的关联度排序如下：绿原酸＞蒙花苷＞木兰脂素＞欧前胡素＞木犀草素
[0234]
其中绿原酸与降低no释放量之间的关联度最大，提示绿原酸与降低no释放量的关系最为密切。
[0235]
关联度大于0.7所对应的峰(蒙花苷、木兰脂素)对降低no释放量也起着一定的协同作用。
[0236]
表24降低no释放量灰色关联度分析结果
[0237]
色谱峰tr/min关联度绿原酸20.9340.7149蒙花苷73.0460.7107木犀草素76.4780.6726木兰脂素115.2180.7016欧前胡素134.7680.6970
[0238]
b)il-6水平
[0239]
进行灰色关联度分析
[0240]
从表25可得，各自变量所代表的化学物质与降低il-6水平之间的关联度排序如下：绿原酸＞蒙花苷＞木兰脂素＞欧前胡素＞木犀草素
[0241]
其中绿原酸与降低il-6水平之间的关联度最大，提示绿原酸与降低il-6水平的关系最为密切。
[0242]
表25降低il-6水平关联度分析结果
[0243]
色谱峰tr/min关联度绿原酸20.8790.7325蒙花苷73.2670.6872木犀草素76.6520.6530木兰脂素115.4080.6862欧前胡素134.8640.6724
[0244]
c)tnf-α水平
[0245]
进行灰色关联度分析
[0246]
从表26可得，各自变量所代表的化学物质与降低tnf-α水平之间的关联度排序如
下：。蒙花苷＞绿原酸＞欧前胡素＞木兰脂素＞木犀草素
[0247]
其中蒙花苷与降低tnf-α水平之间的关联度最大，提示蒙花苷与降低tnf-α水平的关系最为密切。
[0248]
关联度大于0.7所对应的峰(绿原酸、欧前胡素)对降低tnf-α也起着一定的协同作用。
[0249]
表26降低tnf-α水平关联度分析结果
[0250]
色谱峰tr/min关联度绿原酸20.8410.7030蒙花苷73.2250.7522木犀草素76.6250.6724木兰脂素115.4190.6787欧前胡素134.9100.7019