MRPL12蛋白在制备肺腺癌检测产品中的应用的制作方法

mrpl12蛋白在制备肺腺癌检测产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及医学诊断领域，具体而言，为mrpl12蛋白在制备肺腺癌检测产品中的应用。


背景技术：

2.肺癌是起源于肺部支气管粘膜或腺体的恶性肿瘤。全球范围内，肺癌的发病率及死亡率都极高，已经严重的威胁人类的身体健康。肺癌的致病因素主要包括吸烟、空气污染、电离辐射、职业暴露、遗传等。根据组织病理特点，将其分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)和小细胞肺癌 (small cell lung cancer,sclc)。肺腺癌(lung adenocarcinoma,luad)属于nsclc，是肺癌最主要的组织学类型，占总确诊病例的40％～55％。肺腺癌起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺，早期症状隐匿，多数患者确诊时已经处于晚期或发生转移，五年生存率不足20％。目前，肺腺癌的治疗方法分为手术治疗、化疗、放疗、免疫治疗、靶向治疗和中医治疗等。手术切除是肺腺癌治愈率较高的治疗方法，但患者确诊时，只有约25％的患者适合手术治疗。
3.分子标志物是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因、蛋白等物质。近些年，随着分子生物学的研究发展，肿瘤分子标记物已成为临床肿瘤治疗的热点，临床实践已证实肿瘤分子标记物有助于肿瘤的提前诊断、靶向治疗和预后监测，但仍缺乏特异性和灵敏性。新的肿瘤分子标记物的发现对肺腺癌的早诊断、早治疗和预后评价具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供mrpl12蛋白，用于制备肺腺癌检测产品，将产品用于肺腺癌的早期诊断，相比现有的肺腺癌诊断方法，使用蛋白标志物来诊断肺腺癌，具有及时性，灵敏性和普及性。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：mrpl12蛋白在制备肺腺癌检测产品中的应用。
6.进一步的，所述mrpl12蛋白包括mrpl12基因的所有翻译产物，即所述mrpl12蛋白为一种蛋白质；所述mrpl12基因包括mrp12野生型、突变型、剪接型和其片段的任意一种；所述翻译产物包括mrp12蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和糖基化修饰产物、以及剪切产物的任意一种。
7.进一步的，所述mrpl12蛋白为特异性抗体，所述mrpl12蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体片段或修饰抗体的能与mrpl12特异性结合的任何形式的抗体。
8.进一步的，所述mrpl12蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；抗mrpl12 蛋白的抗体可用于免疫组化染色中，检测活检样本中的mrpl12蛋白含量，作为肺腺癌的早期诊断和预后的监测指标；还可用于elisa、免疫印迹分析、同位素示踪、荧光标记检测方法。
9.进一步的，所述检测产品为试剂盒、试纸、蛋白芯片的任意一种。
10.进一步的，所述试剂盒包括elisa检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒等。
11.进一步的，所述试剂盒中的试剂还包括能间接反映mrpl12蛋白含量或活性的与 mrpl12蛋白结合的配体；所述蛋白芯片包括固相载体以及固定在固相载体的mrpl12蛋白的特异性抗体，所述蛋白芯片可用于检测包括mrpl12蛋白在内的多个蛋白的表达水平，将mrpl12蛋白与多个标志物同时检测可提高检测精度。
12.本发明的有益效果是：将mrpl12蛋白用于制备诊断肺腺癌工具(试剂盒等)，具有良好的灵敏性与特异性，将工具用于肺腺癌的早期诊断，解决了目前的肺腺癌分子标志物还不够精确，不够充足的问题，提高对肺腺癌诊断的及时性、灵敏性和普及型，对肺腺癌的早诊断、早治疗和预后评价具有重要意义。
附图说明
13.图1为肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞中mrpl12蛋白表达的western blot条带图；
14.图2为肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞中mrpl12蛋白表达比例的柱状图；
15.图3为免疫组织化学法检测mrpl12蛋白在肺腺癌组织中表达的典型结果图；
16.图4为免疫组织化学法检测mrpl12蛋白在正常肺癌组织中表达的典型结果图；
17.图5为免疫组织化学法检测30对组织样本的统计结果图。
具体实施方式
18.下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
19.实施例
20.mrpl12蛋白在肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞中的差异表达
21.1、细胞培养
22.用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的dmem培养液培养人正常肺上皮细胞 beas-2b，在37℃、5％co2的孵箱中培养。用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素 rpmi-1640培养液培养人luad细胞(h1395，h1975，pc-9和hcc827)，在37℃、 5％co2的孵箱中培养。2-3天更换新鲜培养基，使用含0.25％乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，edta)的胰蛋白酶消化传代。
23.2、蛋白样品制备
24.倒掉培养皿中的培养液，通过pbs洗两次后置于冰上，其后加入100ul裂解液，于冰上裂解10min，再将裂解液收集到预冷1.5ml ep管；将5x sds loading buffer按比例加入蛋白样品；超声波细胞粉碎机中超声2min后，在沸水中加热5min使其变性。
25.3、免疫印迹
26.(1)sds-page凝胶电泳：根据蛋白的分子量大小配制sds-page凝胶；然后按顺序缓慢加入蛋白样品，每孔10ul；电泳选择恒压，浓缩胶70v，分离胶130v，溴酚蓝指示剂到分离胶底部时停止电泳；
27.(2)转膜：根据目的蛋白分子量大小，再结合maker的位置，保留目的蛋白所在的蛋
白胶区域；按照海绵-滤纸-胶-pvdf膜-滤纸-海绵的顺序制作“三明治”，再装入电泳槽中，恒流200ma，转膜2h；
28.(3)封闭：5％脱脂奶粉室温封闭2h或4℃过夜，然后将膜取出，1x tbst洗两次；
29.(4)一抗孵育：使用一抗稀释液按照比例稀释一抗；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，于一抗中室温孵育1h或4℃孵育过夜；然后将膜取出，1x tbst洗三次，每次 5min；
30.(5)二抗孵育：二抗和5％脱脂奶粉按照需要比例稀释；将膜放入二抗中，37℃孵育 1h，然后将膜取出，1x tbst洗三次，每次5min。
31.(6)信号检测：采用ecl化学发光显色，发光液a和b按1:1混合；用滤纸吸去膜上残留液后，将膜与显影液充分接触，再将膜置于显影仪上检测。
32.(7)灰度统计：使用imagej软件对蛋白条带进行定量分析。
33.4、实验结果
34.图1显示mrpl12和gapdh在肺腺癌细胞(h1395，h1975，pc-9和hcc827)和正常肺上皮细胞(beas-2b)的蛋白表达水平。如图2所示，以gapdh蛋白为内参，mrpl12 蛋白在肺腺癌细胞(h1395，h1975，pc-9和hcc827)中的表达量分别是正常肺组织细胞 (beas-2b)的18倍，21倍，4倍，35倍。
35.mrpl12蛋白在免疫组化试剂盒中的应用
36.1、组织样本来源
37.阵列编号为hluga060pg02的30例肺腺癌组织和肺正常组织芯片购于上海芯超生物科技有限公司。其中男性18例，女性12例，年龄38～83岁，均为肿瘤原发灶，无转移，病理分级包括i-iii级，病理分型为肺腺癌。上述组织芯片已通过组织伦理委员会审查。
38.2、实验方法
39.s1烘片：将组织芯片放于63℃烘箱中，烘片1h；
40.s2脱蜡和水化：脱蜡在全自动染色机(仪器型号：leicast5020)中完成，脱蜡顺序依次为二甲苯ⅰ15min-二甲苯ⅱ15min-100％酒精7min-100％酒精7min-90％酒精5min
‑ꢀ
80％酒精5min-70％酒精5min；
41.s3抗原修复：根据“ptlink简明操作规程”，将玻片放入全自动免疫组化预处理系统仪器(仪器型号：pt link)进行抗原修复，修复完毕后，放在室温的蒸馏水中，使其自然冷却至室温；
42.s4淬灭：3％过氧化氢水溶液室温处理10min，以灭活内源性过氧化物酶；0.01％卵白素溶液室温处理20min，以消除内源性生物素的活性；
43.s5封闭：用含5％山羊血清的pbst进行封闭，室温1h；
44.s6一抗孵育：取出玻片，用pbst缓冲液冲洗；加入稀释好的一抗工作液后，于4℃冰箱中保存过夜；
45.s7二抗孵育、阻断、显色：从冰箱中取出玻片，室温复温45min，再用pbst缓冲液清洗；将玻片放入dako全自动免疫组化染色系统仪器(仪器型号：autostainer link 48)，选择相应程序运行阻断、二抗结合、dab显色程序；
46.s8苏木素复染：苏木素染色1min，浸没在0.25％的盐酸酒精(400ml 70％酒精+1ml浓盐酸)中的时间不少于2s，用自来水冲洗2min以上；
47.s9封片、扫描：室温晾干玻片，中性树脂封片；使用aperio扫描仪(仪器型号： aperio xt)扫描分析。
48.3、实验结果
49.组织芯片中的30对样本是在同一光学显微镜，同一曝光强度下采集的图片。图3为典型的肺腺癌组织染色图片，图4为典型的正常肺腺癌组织染色图片。选择不同组织染色图片的相同大小区域，使用imagej软件在相同条件下统计组织中阳性染色面积，并统计肺腺癌组织与正常肺组织染色的差异，如图5所示差异极显著，p值小于0.0001(p《0.05，*； p《0.01，**；p《0.001，***；p《0.0001，****)，表明将mrpl12免疫组化试剂盒用于筛查诊断肺腺癌癌，其特异性和敏感性都非常高。
50.本发明涉及的mrpl12蛋白序列表如下：
51.》人源mrpl12的蛋白序列，全长199aa
52.mlpaaarplwgpclglraaafrlarrqvpcvcavrhmrssghqrcealagapldna pkeyppkiqqlvqdiasltlleisdlnellkktlkiqdvglvpmggvmsgavpaaaaqeave edipiakerthftvrlteakpvdkvklikeiknyiqginlvqakklveslpqeikanvakaea ekikaaleavggtvvle。
53.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。