一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用

一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法及应用，属免疫检测技术领域。


背景技术：

2.布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人畜共患传染病，who将布鲁氏菌病视为“世界范围内流行最广泛的人畜共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”。布病主要是通过直接或间接接触染病动物或动物产品而感染。人类患布病后，会引起发热、肌肉和关节疼痛等，严重者完全丧失劳动能力；家畜感染布病则引起流产和不育，给养殖业造成巨大的经济损失，严重威胁人类食品安全和公共卫生安全。
3.我国自2000年之后，不管是人间还是畜间的布病发生率均呈逐年上升趋势。布病防控面临主要难点在于不能精准剔除阳性动物，导致传染源在群体中的长期存在，布病净化难以实现。现有的布病诊断方法中，间接elisa(ielisa)可检测血清中布鲁氏菌特异性igg抗体，适用于布病的确诊；竞争elisa(celisa) 可同时检测血清中特异性igm和igg抗体，适用于布病的初筛。本发明利用上述两种方法检测抗体类型的差异，通过布病阳性血清国家标准品统一两种方法的检测灵敏度，建立一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量对布病非免疫牛实现准确判定的方法。
4.申请人已成功开发了牛布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒和布鲁氏菌竞争elisa抗体检测试剂盒，均获得了国家三类新兽药证书((2015)新兽药证字 67号、(2016)新兽药证字6号)。以此为基础，通过布病阳性血清国家标准品 (牛源，含量1000iu/ml)对两种试剂盒进行检测灵敏度定量，使两种检测方法的检测灵敏度均为血清中布鲁氏菌特异性抗体含量不低于50iu/ml为阳性。同时其检测灵敏度与布病诊断金标准补体结合试验(cft)的检测灵敏度保持一致，保证检测结果的准确性。对于同一份血清样品同时进行ielisa和celisa 的检测，根据两者的检测结果最终判定阳性、可疑与阴性，从而便于精准剔除布病阳性牛，快速实现布病净化的目的。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种准确性高、操作简便的检测布病阳性牛的方法。
6.本发明的技术方案为：
7.1.一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法，其特征在于该方法由特定布病间接elisa(ielisa)和竞争elisa(celisa)方法组成；采用布病阳性血清国家标准品对布病ielisa和celisa方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病诊断金标准cft方法的检测灵敏度一致，均以血清中布鲁氏菌特异性抗体igg和igm含量不低于50iu/ml为阳性临界值判定标准。
8.2.本发明所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法，其特征在于采
用布病阳性血清国家标准品对布病ielisa和celisa方法的检测灵敏度进行定量。
9.3.本发明所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法，其特征在于所述布病阳性血清国家标准品制备与含量测定方法为：
10.用2ml布鲁氏菌疫苗株a19灭活抗原(4.0
×
10
10
cfu/ml)颈部皮下免疫布病阴性的牛。初免3个月后进行加强免疫，以双倍剂量颈部皮下加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用cft试验测定其效价应不低于1000iu/ml。用布病阴性血清将阳性血清稀释至cft效价为1000iu/ml，加入proclin300至终浓度为 0.05％，无菌分装，冻干后置-20℃保存。
11.4.本发明所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法，其特征在于所述方法布病间接elisa(ielisa)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体igg含量不低于50iu/ml为阳性。
12.5.本发明所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法，其特征在于所述布病间接elisa(ielisa)检测灵敏度的定量方法为：
13.用纯化的布鲁氏菌lps(浓度15μg/ml)作为抗原包被酶标板，每孔100μl。加入封闭液200μl，2～8℃封闭24小时。以洗涤液300μl/孔洗板1次。将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等 5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200iu/ml、100iu/ml、50iu/ml、25 iu/ml、12.5iu/ml。各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶50倍稀释，加入酶标板，每孔100μl，37℃作用30分钟。每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次。将兔抗牛igg抗体用抗体稀释液作1∶200稀释后，每孔加入100μl，37℃作用30 分钟。再次洗涤3次。加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μl 终止液终止反应。在酶标仪下测定od
450nm
值，计算p％值，确定ielisa方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50iu/ml)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25iu/ml)检测为阴性。
14.6.本发明所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法，其特征在于所述方法布病竞争elisa(celisa)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体igg和igm含量不低于50iu/ml为阳性。
15.7.本发明所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法，其特征在于所述布病竞争elisa(celisa)检测灵敏度的定量方法为：
16.用纯化的布鲁氏菌lps(浓度15μg/ml)作为抗原包被酶标板，每孔100μl。加入封闭液200μl，2～8℃封闭24小时。以洗涤液300μl/孔洗板1次。将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等 5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200iu/ml、100iu/ml、50iu/ml、25 iu/ml、12.5iu/ml。各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶20倍稀释，加入酶标板，每孔50μl，同时加入已稀释好的单克隆抗体，每孔50μl，振荡5分钟。 37℃作用30分钟。每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次。将羊抗鼠igg抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μl，37℃作用30分钟。再次洗涤3次。加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μl终止液终止反应。在酶标仪下测定od
450nm
值，计算pi％值，确定celisa方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50iu/ml)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25iu/ml)检测为阴性。
17.8.本发明所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法在布病非免疫牛群中的应用，其特征在于按照如下步骤进行：
18.(1)样品的处理：取牛全血，待血液凝固后，以4000r/分钟离心10分钟，收集上清，
血清应清亮，无溶血。
19.(2)取处理好的血清样品分别按权利要求5和7所述方法进行ielisa和 celisa。
20.(3)结果判定规则为：当血清样品ielisa和celisa检测均为阳性(+) 时，其对应的牛判定为布病阳性牛；当血清样品ielisa和celisa检测均为阴性(－)时，其对应的牛判定为布病阴性牛；当血清样品ielisa检测为阳性(+)， celisa检测为阴性(－)时，或者血清样品ielisa检测为阴性(－)，celisa 检测为阳性(+)时，其对应的牛判定为布病可疑牛；可疑牛需在1个月后再次采样进行检测，最终以ielisa检测结果判定为布病阳性/阴性牛。
21.本发明的有益效果
22.本发明通过检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量实现对布病非免疫牛判定的方法，可用于布病阳性群体中阳性牛的准确剔除。本发明的优势在于通过布病阳性血清国家标准品对布病ielisa和celisa方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病诊断金标准cft方法的检测灵敏度一致，提高了方法的准确性。在同一检测灵敏度条件下，通过ielisa和celisa同时检测血清样品中布鲁氏菌特异性抗体igg和igm的含量，区分布病阳性牛、可疑牛和阴性牛。
附图说明
23.图1为本发明方法的结果判定示意图。
具体实施方式
24.1.本发明建立了一种检测牛布鲁氏菌病特异性igg和igm含量的方法。
25.其核心是利用布病阳性血清国家标准品(牛源，含量1000iu/ml)将布病 ielisa和celisa方法的检测灵敏度定量为血清中布鲁氏菌特异性抗体含量不低于50iu/ml为阳性。将一份血清样品进行ielisa和celisa试验，同时测定血清样本中布鲁氏菌特异性igg和igm含量，用于区分布病阳性牛、可疑牛和阴性牛。
26.本发明所提供的上述通过检测布鲁氏菌特异性igg和igm含量对布病非免疫牛实现准确判定的方法，包括以下步骤：
27.(1)所述布病阳性血清国家标准品(牛源，含量1000iu/ml)，其制备方法为：
28.1)用2ml布鲁氏菌疫苗株a19灭活抗原(4.0
×
10
10
cfu/ml)颈部皮下免疫布病阴性的牛。
29.2)初免3个月后进行加强免疫，以双倍剂量颈部皮下加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用cft试验测定其效价应不低于1000iu/ml。
30.3)用布病阴性牛血清将阳性血清稀释至cft效价为1000iu/ml，加入proclin 300至终浓度为0.05％，无菌分装，冻干后置-20℃保存。
31.(2)所述布病ielisa方法及其检测灵敏度的定量方法为：
32.1)用纯化的布鲁氏菌lps(浓度15μg/ml)作为抗原包被酶标板，每孔100μl。
33.2)加入封闭液(含3％明胶的0.01mph7.4的pbs)200μl，2～8℃封闭24 小时。
34.3)以洗涤液300μl/孔洗板1次，弃去洗涤液。
35.4)将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶ 40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200iu/ml、100iu/ml、 50iu/ml、25iu/ml、12.5iu/
ml。各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶50倍稀释，加入酶标板，每孔100μl，37℃作用30分钟。
36.5)取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次，最后1 次甩干或拍干。
37.6)将兔抗牛igg抗体用抗体稀释液作1∶200稀释后，每孔加入100μl，37℃作用30分钟。洗涤3次，甩干。
38.7)加入底物显色液100μl/孔，室温避光显色15分钟后，每孔加50μl终止液终止反应。
39.8)反应终止后，15分钟内在酶标仪下测定od
450nm
值。
40.9)计算p％值，确定ielisa方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50iu/ml)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即 25iu/ml)检测为阴性。
41.(3)所述布病celisa方法及其检测灵敏度的定量方法为：
42.1)用纯化的布鲁氏菌lps(浓度15μg/ml)作为抗原包被酶标板，每孔100μl。
43.2)加入封闭液(含3％明胶的0.01mph7.4的pbs)200μl，2～8℃封闭24 小时。
44.3)以洗涤液300μl/孔洗板1次，弃去洗涤液。
45.4)将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200iu/ml、100iu/ml、50iu/ml、25iu/ml、12.5iu/ml，各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶20倍稀释，加入酶标板，每孔50μl。加入已稀释好的单克隆抗体，每孔50μl，振荡 5分钟。37℃作用30分钟。
46.5)取出反应板，弃去反应液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤3次，最后1 次甩干或拍干。
47.6)将羊抗鼠igg抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μl，37℃作用30分钟。洗涤3次，甩干。
48.7)加入底物显色液100μl/孔，室温避光显色15分钟后，每孔加50μl终止液终止反应。
49.8)反应终止后，15分钟内在酶标仪下测定od
450nm
值。
50.9)计算pi％值，确定celisa方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50iu/ml)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即 25iu/ml)检测为阴性。
51.(4)所述检测布鲁氏菌特异性igg和igm含量实现对布病非免疫牛准确判定的方法，按照如下步骤进行：
52.1)样品处理：取牛全血，待血液凝固后，以4000r/分钟离心10分钟，收集上清，血清应清亮，无溶血。
53.2)取处理好的血清样品分别按上述方法进行ielisa和celisa。
54.3)结果判定规则为：当血清样品ielisa和celisa检测均为阳性(+)时，其对应的牛判定为布病阳性牛；当血清样品ielisa和celisa检测均为阴性(－) 时，其对应的牛判定为布病阴性牛；当血清样品ielisa检测为阳性(+)，celisa 检测为阴性(－)时，或者血清样品ielisa检测为阴性(－)，celisa检测为阳性(+)时，其对应的牛判定为布病可疑牛；可疑牛需在1个月后再次采样进行检测，最终以ielisa检测结果判定为布病阳性/阴性牛。
55.2.本发明的检测原理
56.当含有布鲁氏菌特异性抗体igg和igm的牛血清样品进行ielisa和celisa 时，如血清样品中布鲁氏菌特异性抗体igg含量≥50iu/ml，且igg和igm总含量≥50iu/ml时，ielisa和celisa检测均为阳性(+)；如血清样品中布鲁氏菌特异性抗体igg含量＜50iu/ml，但igg和igm总含量≥50iu/ml时， ielisa检测为阴性(－)，celisa检测为阳性(+)。当血清中不含有布鲁氏菌特异性抗体，或者igg和igm总含量＜50iu/ml，ielisa和celisa检测均为阴性(－)。
57.以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
58.实施例1——用布病阳性血清国家标准品(牛源，含量1000iu/ml)测定 ielisa和celisa方法的检测灵敏度
59.1.布病阳性血清标准品的稀释：用1ml生理盐水将布病阳性血清标准品复溶。再用生理盐水将血清进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200iu/ml、100iu/ml、50iu/ml、25iu/ml、 12.5iu/ml。
60.2.采用ielisa、celisa和cft分别检测5个不同稀释度布病阳性血清标准品，每个稀释度重复3次，结果取其平均值，确定各方法的检测灵敏度。检测方法的判定标准如下：牛布病ielisa判定标准为p％值≥20％时，为牛布病抗体阳性(+)；p％值＜20％时，为牛布病抗体阴性(－)。布病celisa判定标准为pi％值≥30％时，为布病抗体阳性(+)；pi％值＜30％时，为布病抗体阴性(－)。 cft判定标准为100％溶血为布病抗体阴性(－)；50％～90％溶血为布病抗体可疑(+)；0～40％溶血为布病抗体阳性(+)。
61.3.检测方法灵敏度测定结果见表1。ielisa、celisa和cft方法的检测灵敏度结果一致，即布病阳性血清标准品稀释1∶20(即50iu/ml)均检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25iu/ml)均检测为阴性。
62.表1检测方法灵敏度检测结果
[0063][0064]
实例2——检测布鲁氏菌特异性igg和igm含量对布病非免疫牛实现准确判定的方法之临床验证试验(一)
[0065]
1. 2021年6月申请人实验室采集华东某大型布病非免疫奶牛场血清临床样品215份，用补体结合试验(cft)进行确诊，cft判定标准为100％溶血为布病抗体阴性(－)；50％～90％溶血为布病抗体可疑(+)；0～40％溶血为布病抗体阳性(+)。经cft确诊，结果47份为阳性，168份为阴性。
[0066]
2.将上述215份牛血清样品分别按本发明所述ielisa和celisa方法进行检测，检测方法的判定标准如下：牛布病ielisa判定标准为p％值≥20％时，为牛布病抗体阳性(+)；p％值＜20％时，为牛布病抗体阴性(－)。布病celisa 判定标准为pi％值≥30％时，为布病
抗体阳性(+)；pi％值＜30％时，为布病抗体阴性(－)。结果ielisa方法检出47份阳性，168份阴性；celisa方法检出 71份阳性，144份阴性。其中ielisa与cft检测结果符合率100％；由于celisa 与ielisa、cft方法相比，除了检出igg，还可检出igm，因此celisa检出阳性样品比ielisa、cft多24份。
[0067]
3.根据ielisa和celisa检测结果，依据本发明判定规则判定布病阳性牛、可疑牛、阴性牛。当血清样品ielisa和celisa检测均为阳性(+)时，其对应的牛判定为布病阳性牛；当血清样品ielisa和celisa检测均为阴性(－)时，其对应的牛判定为布病阴性牛；当血清样品ielisa检测为阳性(+)，celisa 检测为阴性(－)时，或者血清样品ielisa检测为阴性(－)，celisa检测为阳性(+)时，其对应的牛判定为布病可疑牛；可疑牛需在1个月后再次采样进行检测，最终以ielisa检测结果判定为布病阳性/阴性牛。
[0068]
4.临床样品检测结果：ielisa和celisa均检测为阳性的样品47份，其对应牛判定为布病阳性牛；ielisa检测为阴性，而celisa检测为阳性的样品24 份，其对应的牛判定为布病可疑牛；ielisa和celisa均检测为阴性样品144 份，其对应的牛判定为布病阴性牛。
[0069]
实例3——检测布鲁氏菌特异性igg和igm含量对布病非免疫牛实现准确判定的方法之临床验证试验(二)
[0070]
1. 2019年7月申请人实验室接受了山东某韩资奶牛企业540头布病非免疫奶牛的确诊委托试验，实验室按本发明所述ielisa和celisa方法进行检测，检测方法的判定标准如下：牛布病ielisa判定标准为p％值≥20％时，为牛布病抗体阳性(+)；p％值＜20％时，为牛布病抗体阴性(－)。布病celisa判定标准为pi％值≥30％时，为布病抗体阳性(+)；pi％值＜30％时，为布病抗体阴性(－)。结果ielisa方法检出303份阳性，237份阴性；celisa方法检出319份阳性， 221份阴性。其中ielisa与celisa共同检测的阳性样本为303份，celisa阳性但ielisa阴性的样本16份，ielisa与celisa共同检测的阴性样本为221 份。进一步通过cft对540份样本进行了确认检测，结果cft同样检测到303 份阳性样本，且编号与ielisa检测结果完全一致。本发明申请人做出了：303 头阳性牛、221头阴性牛、16头可疑牛的检测结论。建议企业立即淘汰阳性牛，隔离可疑牛，转移阴性牛单独饲养，做好日常消毒，可疑牛禁止配种的建议。同时要求奶牛企业2个月之后，待潜在的布病阳性牛暴露之后再次全群采样进行确诊。
[0071]
2. 2019年9月，韩资奶牛企业将全群221头第一次检测为阴性的奶牛及16 头可疑牛送专利申请人实验室再次诊断。根据ielisa和celisa检测结果，从 221头阴性牛中再次检测出1头阳性牛，2头可疑牛；从16头第一次检测为可疑的奶牛中确诊了9头为布病阳性牛，7头阴性牛。申请人做出了：淘汰10头阳性牛及2头可疑牛的建议，做好日常消毒。要求6个月之后再次全群检测。第二次检测结果初步确定第一次诊断的准确性达到99.55％(220/221)。
[0072]
3. 2020年4月20日，韩资奶牛企业将全群225头再次采用送专利申请人检测确认，本次检测结果为ielisa全部为阴性，celisa全部为阴性。申请人认为该牧场已经实现了布病净化，但需做好日常消毒，建议3个月之后再次全群采样，确认是否实现布病净化。
[0073]
4. 2020年6月28日，韩资奶牛企业将全群234头(含新生的9头小牛， 225+9＝234)采样送申请人再次检测。本次检测结果为ielisa全部为阴性， celisa全部为阴性。申请人再次用cft试验进行确认，结果同样为阴性。至此，该牧场实现了布病净化。