一种地奈德洗剂有关物质的高效液相色谱检测方法与流程

本发明属于药物分析，具体涉及一种运用高效液相色谱检测地奈德洗剂有关物质的方法。

背景技术：

1、地奈德洗剂是一种低效的皮质类固醇，可缓解皮质类固醇反应性皮肤病的炎症性和瘙痒性表现。目前，地奈德上市相关剂型有：凝胶剂、洗剂、油膏、乳膏。

2、地奈德洗剂适用于对皮质类固醇治疗有效的各种皮肤病，如接触性皮炎、神经性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹、银屑病、扁平苔藓、单纯性苔藓、汗疱症等引起的皮肤炎症和皮肤瘙痒的治疗。本品为糖皮质激素类药物，具有抗炎、抗过敏、止痒及减少渗出作用；可以减轻和防止组织对炎症的反应，能消除局部非感染性炎症引起的发热、发红及肿胀，从而减轻炎症的表现；具有防止或抑制细胞免疫反应、抑制初次免疫应答的免疫抑制作用。

3、地奈德的基本信息如下：

4、中文名：地奈德

5、英文名：desonide

6、结构式：

7、

8、分子式：c24h32o6

9、分子量：416.51

10、中文化学名：11-β，21-二羟基-16α，17-[(1-甲基亚乙基)-二氧]孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮

11、英文化学名：(pregna-1,4-diene-3,20-dione,11,21-dihydroxy-16,17-[(1-methylethylidene)bis(oxy)]-,(11β,16α))

12、地奈德具有光敏性，光照不稳定；水溶液及光照条件下易分解。在usp43地奈德质量标准中公布了常见的地奈德已知杂质有8种，分别为16-羟基泼尼松龙(地奈德杂质a)、泼尼松龙(地奈德杂质b)、乙二醛地奈德(地奈德杂质c)、16-烯去羟泼尼松龙(地奈德杂质d)、二氢地奈德(地奈德杂质e)、环氧地奈德(地奈德杂质f)、9-溴地奈德(地奈德杂质g)、乙酰地奈德(地奈德杂质h)。

13、目前在美国药典usp43中收载了地奈德原料有关物质的质量标准(具体方法参见表2)，尚无地奈德洗剂有关物质的相关药典标准，申请人在研究过程中发现，地奈德洗剂中添加了抑菌剂羟苯甲酯、羟苯丙酯，两种辅料在紫外光区有较强的色谱吸收，无法根据usp标准确定制剂中羟苯甲酯、羟苯丙酯与已知杂质的分离情况。

14、表1地奈德洗剂杂质列表

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16、表2美国药典usp43收载地奈德有关物质方法

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技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术缺少地奈德洗剂有关物质的分离检测方法，利用高效液相色谱技术对其流动相组成及其洗脱梯度、色谱柱、进样体积、柱温、供试品溶液配制方法、系统适用性溶液、提取溶剂等进行了开发及优化，开发一种同时能用于地奈德及其洗剂有关物质的高效液相色谱测定方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明公开了一种地奈德洗剂有关物质的高效液相色谱检测方法，该方法包括以下步骤：

4、(1)样品溶液配制：

5、a.供试品溶液：避光操作，精密称取地奈德洗剂3g，加提取溶液6ml，水浴加热2min并充分搅拌使地奈德溶解，转移至20ml棕色量瓶中，用0.1％磷酸溶液洗涤烧杯，洗液并入量瓶中，放冷，用0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，以每分钟10000转离心10分钟，取清液，即得；

6、b.系统适用性溶液：

7、精密称取地奈德对照品与各杂质对照品，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中分别含地奈德75μg、羟苯甲酯120μg、羟苯丙酯60μg及各杂质0.38μg的混合溶液；

8、(3)测定法：精密量取上述溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱条件：用辛烷基键合硅胶为填充剂的反向液相色谱柱；以酸性的磷酸水溶液为流动相a，有机相为流动相b，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm，梯度洗脱程序为：

9、

10、根据本发明的实施方式，采用本发明方法可有效地控制地奈德洗剂的有关物质，其中：步骤(1)中提取溶液选自甲醇、乙腈，依据地奈德在不同溶剂中的溶解度，分别将甲醇与乙腈作为提取溶剂，结果表明甲醇作为取溶剂时，提取液浑浊，当乙腈作为提取溶剂时，提取液液澄清，地奈德提取完全。因此，步骤(1)中提取液优选乙腈。

11、步骤(1)中水浴温度选自60～80℃，根据不同辅料的熔点考察了不同水浴温度(60℃、70℃、80℃)，结果表明不同水浴温度有关物质检测水平基本一致，70℃水浴时本品可充分溶解，最终确定水浴温度为70℃。

12、步骤(1)中水浴时间选自1～5min，本发明考察了70℃不同水浴加热时间(1min、2min、3min、5min)，结果表明不同时间有关物质检测水平基本一致，考虑到水浴加热1min，本品可能未完全溶解，最终确定水浴加热时间为2min。

13、步骤(1)中转速选自8000～10000rpm，离心时间选自5～15min，本发明考察了供试品溶液分别经8000rpm离心5min、10000rpm离心5min、10000rpm离心10min及10000rpm离心15min观察现象，10000rpm离心10min及15min后，固液分离较彻底且溶液清澈，进样结果表明不同转速，不同时间离心后有关物质检测水平基本一致，为简便操作，最终确定供试品溶液经10000rpm离心10min。根据本发明的实施方式，步骤(1)中系统适用性溶液中杂质对照品包含地奈德制剂中的两种抑菌剂羟苯甲酯与羟苯丙酯。

14、本技术发明人通过研究发现，现有的usp43版地奈德原料药质量标准采用反相高效液相色谱法来检测地奈德洗剂有关物质的存在一定的局限性，原因在于：(1)地奈德洗剂中添加了抑菌剂羟苯甲酯与羟苯丙酯，该两种辅料在紫外光区有较强的色谱吸收，usp43地奈德原料药质量标准中系统适用性溶液定入杂质a～h，无法准确了解制剂中羟苯甲酯、羟苯丙酯与已知杂质的分离情况；(2)采用usp43地奈德原料药质量标准中的色谱洗脱梯度对自研制剂与参比制剂进行分析，有未知杂质干扰杂质a出峰；(3)地奈德洗剂的标示量为0.05％，地奈德含量较低，所以在地奈德洗剂有关物质测定色谱方法下进样量增为50μl，usp43地奈德原料药质量标准中溶剂组成比例为0.1％磷酸水溶液-乙腈(60：40)，会造成溶剂效应。

15、进一步地，本发明对地奈德洗剂中杂质a～h及两种抑菌剂羟苯甲酯、羟苯丙酯进行分离与研究。本发明公开的色谱方法中，由于流动相a是酸性的磷酸水溶液，其ph＜7，在选择色谱柱时需重点考虑色谱柱的耐受范围，本技术的发明人筛选了菲罗门kenitex c8(150mm×4.6mm，2.6μm)及ace 3 c18(150mm×4.6mm)、horizon aurashell c8(150mm×4.6mm，2.7μm)等色谱柱分离各杂质，发现ymc meteoric core型色谱柱可以在比较宽的ph范围使用且能获得较好的杂质分离。

16、根据本发明的实施方式，本发明采用的高效液相色谱法中的反相色谱柱选自ymcmeteoric core c8，其规格为150mm×4.6mm，2.7μm。

17、根据本发明的实施方式，流动相a为水相，为酸性的磷酸水溶液，选自0.08％～0.12％磷酸水溶液；流动相b选自甲醇、乙腈。

18、优选地，流动相a选自0.1％磷酸水溶液；流动相b选自乙腈。

19、根据本发明的实施方式，本发明公开的高效液相色谱法中，当流速选自1.0ml/min，柱温对杂质的分离有很大影响，经研究，柱温选自25℃，检测波长选自254nm，制剂中地奈德的含量较低，所以制剂进样体积选自50μl时，能够有效的分离地奈德洗剂的有关物质，从而确保了地奈德洗剂的质量可控。

20、根据本发明的实施方式，采用本发明方法可有效地控制地奈德制剂的有关物质，系统适用性溶液色谱图中，各组分的出峰顺序依次为杂质a、杂质b、羟苯甲酯、杂质c、杂质d、地奈德、杂质e、杂质f、杂质g、羟苯丙酯、杂质h；杂质c与杂质d峰之间的分离度不小于2.0，地奈德峰与杂质e峰之间的分离度不小于2.0，羟苯甲酯、羟苯丙酯均不干扰已知杂质出峰，与已知杂质可有效分离。

21、本发明的有益效果是：

22、(1)本发明公开了地奈德洗剂供试品溶液的处理过程，筛选出较好提取溶剂，操作过程简便；

23、(2)本发明首次公开了地奈德洗剂的有关物质检测方法，所公开的检测方法专属性强、灵敏度高，精密度及线性关系良好，可以用作地奈德洗剂的质量控制，对地奈德洗剂的有关物质的检测具有积极的效果和实际应用价值。