一种皂角的鉴别模型及其建立方法应用

1.本发明属于农作物品种鉴定技术领域。更具体地，涉及一种皂角的鉴别模型及其建立方法应用。


背景技术：

2.皂角(gleditsia sinensis lain)，别名皂荚，属于豆科皂荚属落叶乔木，全世界约16种，多生长在热带和温带地区，其中我国常见的皂荚属植物有皂荚(gleditsia sinensis lam.)、华南皂荚(gleditsia fera(lour.)merr.)、野皂荚(gleditsia microphylla gordonexy.t.lee)、山皂荚(也称为日本皂荚，gleditsia japonica miq.)和滇皂荚(gleditsia japonica miq.var.delavayi(franch.)l.c.li)等。皂荚种类较多，目前对于鉴别皂荚、山皂荚品种的鉴别方法较少。中国专利申请公开了一种源自皂荚的三种药材的鉴别方法及其应用，其采用反相超高效液相色谱与四级杆飞行时间质谱联用的技术，实现对皂荚属三种中药大皂角、猪牙皂和皂角刺的精准分析与鉴别，其虽然可以鉴别皂荚属中的大皂角、猪牙皂和皂角刺，但其并不能精准鉴别出皂荚和山皂荚的品种。


技术实现要素：

3.本发明要解决的技术问题是克服现有缺乏鉴别皂荚和山皂荚品种方法的缺陷，提供一种能简便、准确、有效地鉴别皂角中皂荚和山皂荚品种的方法。
4.本发明的另一目的是提供一种鉴别皂角品种的模型。
5.本发明的另一目的是提供一种鉴别皂角品种模型的建立方法。
6.本发明的另一目的是提供一种鉴别皂角品种的方法和模型在鉴别皂角品种中的应用。
7.本发明的上述目通过以下技术方案实现：
8.本发明保护一种鉴别皂角品种模型的建立方法，包括如下步骤：
9.先将皂角前处理所得皂角米用甲醇摇床提取10～30min，将提取物用lc-q-tof/ms进行检测得到每个成分的色谱峰面积，再用opls-da对色谱峰面积分析得到vip值，用vip值大于1对应成分的色谱峰面积用spss26软件建立模型，过程为：将皂角米的品种作为分组变量，分组变量的范围为1～3，vip值大于1对应的成分及其峰面积数据作为自变量，描述设置为平均值、单变量anova和box’s m三项，矩阵设置为组内相关性和组内协方差，函数系数设置为fisher；在分类选项中，先验概率设置为所有组相等，使用协方差矩阵设置为分组；最终通过预测组成员和判别得分，得到分类函数系数表，将函数系数表整理成方程即得鉴别皂角品种的模型。
10.优选地，所述lc-q-tof/ms中液相色谱的条件为：
11.色谱柱：waters beh c18：
12.流动相：流动相a为0.1～0.15％v/v甲酸，流动相b为乙腈；
13.梯度洗脱：0～20min，5％～90％b；20～25min，90％～100％b；25～43min，100％b；
43～44min，100％～5％b；44～50min，5％b或0～10min 5％～90％b，10～13min 90％-～100％b，13～17min 100％b，17～17.5min 100％～5％b，17.5～20min 5％b。
14.流速：0.2～0.8ml/min；
15.进样量：4～6μl；
16.柱温38～45℃。
17.优选地，所述lc-q-tof/ms中四级杆飞行时间质谱的条件为：
18.正离子模式进样量4～6μl；
19.负离子模式进样量15～25μl；
20.柱温35～45℃；
21.接口方式：esi和apci复合源；
22.一级tof-ms扫描准确质量范围50～2500da，数据采集时间80～100ms；
23.二级ida-ms扫描准确质量范围50～2500da，高灵敏模式，数据采集时间40～60ms；
24.信号阈值：80～100cps。
25.优选地，所述提取物用lc-q-tof/ms进行检测前还包括将提取物离心，取上清液过有机滤膜分离至试管中，用氮气吹干，加1～2ml甲醇复溶，涡旋混匀1～2min，过有机滤膜。
26.更优选地，所述离心的转速为10000～15000r/min。
27.优选地，所述vip值大于1所对应成分的色谱峰面积为triacanthine的色谱峰面积，locustoside a的色谱峰面积，locustoside b的色谱峰面积。
28.优选地，所述皂角米与甲醇的质量体积比为：0.1g:(1～2)ml。
29.更优选地，所述皂角米与甲醇的质量体积比为：0.1g:(1～1.5)ml。
30.优选地，所述摇床提取的时间为10～20min。
31.优选地，所述前处理的方法包括：将不同品种的皂角籽经过三轮人工分拣，保留完好健康的种子，用热水溶胀处理，在洁净工作区手工剥离，得到皂角米，于55℃烘干，粉碎过60目筛网密封。
32.本发明进一步保护一种鉴别皂角品种的模型，由上述方法得到。
33.优选地，所述模型如下：
34.y
gs
＝-0.005*x
1-9.733*10-5
*x
2-28.077
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
35.y
gj-d
＝0.113*x1+0.003*x
2-0.001x
3-459.274
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
36.y
gj
＝1.050*x1+0.005*x
2-0.003*x
3-4045.087
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(3)
37.其中gs为皂荚，gj-d为山皂荚变种，gj为山皂荚，x1为triacanthine的色谱峰面积，x2为locustoside a的色谱峰面积，x3为locustoside b的色谱峰面积。
38.本发明进一步保护一种鉴别皂角品种的方法，包括如下步骤：
39.将待测皂角用质谱进行检测，得到triacanthine的色谱峰面积，locustoside a的色谱峰面积，locustoside b的色谱峰面积，将其代入上述模型中计算，所得最大数值对应的y就是该类皂角米。
40.本发明进一步保护上述模型或方法在鉴别皂角品种中的应用。
41.本发明具有以下有益效果：
42.本发明采用甲醇提取皂角米具有较好的提取效果，能够提取鉴别得到14种活性成分，进一步将甲醇提取所得活性成分的lc-q-tof检测数据模拟建立鉴别模型，得到的模型
对于皂角品种的鉴别准确率可达到100％。
附图说明
43.图1为实施例2中对皂角的opls
–
da聚类效果图。
44.图2为实施例2中对皂角的opls
–
da典则判别分类效果图。
45.图3为对比例1中对皂角的opls
–
da聚类效果图。
具体实施方式
46.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
47.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
48.皂角前处理：将不同品种的皂角籽经过三轮人工分拣，保留完好健康的种子，混匀，用热水溶胀处理，在洁净工作区手工剥离，得到皂角米和皂角子叶，分别于55℃烘干，粉碎过60目筛网密封。
49.实施例1皂角米提取物质的成分分析。
50.活性成分确定：将不同品种的皂角籽经过三轮人工分拣，保留完好健康的种子，混匀，用热水溶胀处理，在洁净工作区手工剥离，得到皂角米，于55℃烘干，粉碎过60目筛网得皂角米粉末，取皂角米粉末0.5g于50ml离心管中，加入5.00ml甲醇，摇床提取20min，提取的物质在10000r/min离心，取上清液过有机滤膜分离至试管中，用氮气吹干，加1ml甲醇复溶，涡旋混匀1min，过有机滤膜用lc-q-tof进行测试，并应用mass-hunter软件解析，检测出25个活性成分(表1)，与现有皂角中活性成分对比(表2)。lc-q-tof的参数为：
51.液相色谱的条件为：
52.色谱柱：waters beh c18：
53.流动相：流动相a为0.1％v/v甲酸，流动相b为乙腈；
54.梯度洗脱：0～20min，5％～90％b；20～25min，90％～100％b；25～43min，100％b；43～44min，100％～5％b；44～50min，5％b。
55.流速：0.5ml/min；
56.进样量：4μl；
57.柱温38℃。
58.优选地，所述lc-q-tof/ms中四级杆飞行时间质谱的条件为：
59.正离子模式进样量5μl；
60.负离子模式进样量20μl；
61.柱温40℃；
62.接口方式：esi和apci复合源；
63.一级tof-ms扫描准确质量范围50～2500da，数据采集时间100ms；
64.二级ida-ms扫描准确质量范围50～2500da，高灵敏模式，数据采集时间50ms；
65.信号阈值：100cps。
66.表1皂角米提取物中检测到的活性物质
67.[0068][0069]
表2皂角中常见的活性物质
[0070][0071]
由表1和表2对比可得：本发明提取的活性物质中，含有14种皂角中常见的活性物质，分别为生物碱6个，包含saikachinoside a、locustoside b、locustoside a、saikachinoside b、saikachinoside c、triacanthine；黄酮类化合物4个，分别为vicenin-3、isovitexin、vitexin、dihydrokaempferol；维生素3个，分别为烟酰胺、烟酸、吡哆醇；其
它化学物质1个，为cytochalasin h。
[0072]
实施例2皂角品种鉴别模型的建立
[0073]
经过非参数检验(friedman检验和kendall w检验)，渐进显著性数值大于0.05，则样本类别之间无显著性，小于0.05则分类有显著性。结果显示14个活性成分对于区分三类皂角米具有显著性(渐进显著度均小于0.05)，分别是saikachinoside a，saikachinoside b，saikachinoside c，locustoside b，locustoside a，triacanthine，vicenin-3，isovitexin，vitexin，dihydrokaempferol，烟酸和吡哆醇。
[0074]
其中山皂荚变种的locustoside b、locustoside a、saikachinoside c、isovitexin和烟酸含量比常规皂荚和山皂荚的含量显著较高；saikachinoside b的含量则反之，在皂荚、山皂荚中含量更高；山皂荚中的vicenin-3、吡哆醇、triacanthine的含量比另外两类皂角高；而皂荚中的dihydrokaempferol含量相对较高。
[0075]
采用实施例1的提取方法进行提取，检测分析后，将所得14个显著性变量活性成分含量采用simca进行正交偏最小二乘判别分析(opls-da)，进一步删减获得变量投影重要度(vip值)大于1的显著性成分，结果如表3所示：
[0076]
表3皂角米活性物质opls-da所得vip值
[0077][0078]
[0079]
由表3可知，vip值大于1的有3个，分别为triacanthine、locustoside a和locustoside b。
[0080]
将3种品种的皂角中triacanthine、locustoside a和locustoside b的峰面积进行主成分分析(pca)和典则判别分类分析，如图1～2所示：
[0081]
如图1所示：不同品种之间距离较远，分离效果较好，同一品种的聚集效果明显，说明聚类效果好。如图2所示：同一品种的样品聚集，不同品种的样品呈明显分离的状态，证明该方法鉴别皂角品种效果好。在这个基础上建立模型能够拥有更好的预测准确度，即能通过triacanthine、locustoside a和locustoside b的含量更加准确地预测未知样品的物种。
[0082]
采用spss26软件对上述3个物质的峰面积数据进行模型建立：分析
→
分类
→
判别式，在弹出窗口中将皂角米的物种来源作为分组变量，定义分组变量的范围为1～3，然后将3个物质及其峰面积数据作为自变量，勾选后一起输入自变量选项；在统计选项中勾选【描述】为平均值、单变量anova和box’s m三项，勾选【矩阵】中组内相关性和组内协方差，【函数系数】勾选fisher；在分类选项中，【先验概率】选择所有组相等，【使用协方差矩阵】勾选分组；保存选项中勾选预测组成员和判别得分，点击确定即得到得到分类函数系数(表4)和判别分析结果(表5)。
[0083]
表4分类函数系数
[0084][0085][0086]
应用表4中的数据得到以下方程，即为鉴别皂角品种的模型。
[0087]ygs
＝-0.005*x
1-9.733*10-5
*x
2-28.077
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0088]ygj-d
＝0.113*x1+0.003*x
2-0.001x
3-459.274
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0089]ygj
＝1.050*x1+0.005*x
2-0.003*x
3-4045.087
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(3)
[0090]
其中gs为皂荚，gj-d为山皂荚变种，gj为山皂荚，x1为triacanthine的色谱峰面积，x2为locustoside a的色谱峰面积，x3为locustoside b的色谱峰面积。
[0091]
当把未知样本的三个物质的峰面积代入方程式之后，获得最大的数值的那个方程所对应的y就是该皂角的品种。
[0092]
判别分析结果如表5所示，对三种品种的皂角判别准确率均为100％。
[0093]
表5判别准确率分析结果
[0094][0095]
实施例3皂角品种鉴别模型准确性的验证
[0096]
将3个未知品种的皂角按照实施例1的提取方式提取检测后，将测得triacanthine的峰面积，locustoside a的峰面积，locustoside b的峰面积，代入实施例2的模型中计算，测试结果如表6。
[0097]
表6未知品种皂角的鉴定结果
[0098][0099]
如表6所示：对未知样品1、2、3的数据经过计算，所得最大函数值即为物种预测结果，分别被判别为皂荚、山皂荚变种和山皂荚，与其实际品种进行对比，准确率为100％，说明已构建的鉴别模型能100％预测未知样品的物种。
[0100]
对比例1用80％乙醇及多种溶剂的提取方法进行建模
[0101]
使用80％乙醇对前处理(前处理方法与实施例1一致)后所得皂角米进行15min超
声提取，离心沉淀后再次加入80％乙醇于60℃提取3h，在经过10000r/min离心1min，合并上清液用户氮气吹至近干后，加5ml纯水复溶后加入3g氯化钠(此提取液为水相1)，首先使用石油醚萃取，分离两相后得到水相2和石油醚相，水相2加入氯仿萃取，分离两相后得到水相3和氯仿相，水相3加入乙酸乙酯萃取，分离两相后得到水相4和乙酸乙酯相，水相4加入水饱和正丁醇进行萃取，得到水相5和正丁醇相，将所得5种有机相和5种水相分别通过0.22μm滤膜加入进样小瓶后用lc-q-tof进行测试(方法与实施例1一致)，并应用mass-hunter软件解析。
[0102]
测试结果：与实施例1相比，对对比例1提取方法进行检测，未能测到saikachinoside c、nicotinamide、nicotinic acid、pyridoxine、palmitic acid、daucosterol等物质。经过非参数检验(friedman检验和kendall w检验)后，发现13个活性成分对于区分三类皂角米具有显著性(渐进显著度均小于0.05)，分别是saikachinoside a、triacanthine、vicenin-i、pantothenic acid、isovitexin、l-carnitine、stigmasterol、pyridoxamine、isoorientin、pyridoxamine、thiamine、zizyberanalic acid、d:c-friedours-7-en-3-one。
[0103]
将所得13个显著性变量活性成分含量采用simca进行正交偏最小二乘判别分析(opls-da)，进一步删减获得变量投影重要度(vip值)大于1的显著性成分，结果如表7所示：
[0104]
表7皂角米活性物质opls-da所得vip值
[0105]
显著变量活性成分vip值saikachinoside a3.97797triacanthine1.833vicenin-i1.66696pantothenic acid1.14477isovitexin0.36961l-carnitine0.273349stigmasterol0.137358pyridoxamine0.0731761isoorientin0.0639193pyridoxamine0.0513414thiamine0.0408671zizyberanalic acid0.0337438d:c-friedours-7-en-3-one0.0215286
[0106]
由表7可知，vip值大于1的显著性成分有4个，分别为saikachinoside a、triacanthine、vicenin-i和pantothenic acid。
[0107]
将3种品种的皂角中saikachinoside a、triacanthine、vicenin-i和pantothenic acid的峰面积进行主成分分析(pca)和判别分析，如图3所示：
[0108]
如图3所示：辽宁的山皂荚样品能显著与其他样品区分，贵州山皂荚变种样品与其他皂荚样品区分不明显，聚类效果较差，根据此聚类结果建立模型的预测准确度并不高。
[0109]
采用spss26软件以实施例2同样的方法得到分类函数系数如表8。
[0110]
表8分类函数系数
[0111][0112]
应用表8中的数据得到以下方程，即为鉴别皂角品种的模型。
[0113]ygs
＝1.922*10-5
x4–
0.002x
5-8.401*10-5
x6+0.002x
7-14.756
ꢀꢀ
(1)
[0114]ygj-d
＝1.610*10-5
x
4-0.003x
5-5.997*1
0-5
x6+0.002x
7-12.419
ꢀꢀ
(2)
[0115]ygj
＝-2.589*1
0-5
x4+0.023x
5-2.178*10-5
x
6-0.015x
7-339.322
ꢀꢀ
(3)
[0116]
式中x4为saikachinoside a的色谱峰面积，x5为triacanthine的色谱峰面积，x6为vicenin-i的色谱峰面积，x7为pantothenic acid的色谱峰面积。
[0117]
当把未知品种的皂角样本四个物质的峰面积代入方程式之后，获得最大的数值的那个方程对应的y就是该皂角品种。判别分析结果经过spss26统计得出，如表9所示，准确率仅为78.0％，比采用实施例1提取方法所得模型的准确率显著降低。
[0118]
表9判别准确率分析结果
[0119][0120][0121]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。