与IgA肾病诊断及预后相关的生物标志物组合物及应用

与iga肾病诊断及预后相关的生物标志物组合物及应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，特别是涉及与iga肾病诊断及预后相关的生物标志物组合物及应用。


背景技术：

2.iga肾病(iga nephropathy，igan)是一种iga在肾小球系膜区异常沉积所引起的慢性肾小球肾炎。它是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病，也是导致我国终末期肾脏病(end stage renal disease，esrd)最重要的疾病。igan的发病机制目前尚未完全阐明，其临床和肾脏病理表现多样，治疗手段有限，对治疗反应不一，预后也各异。因此，早期诊断igan并及时评估疾病进展程度，给予个体化的干预治疗对延缓病情、改善预后十分重要。
3.目前对igan的确诊和评估仍然依赖肾穿刺活检，但由于这一操作的有创性，患者对其接受度较低，且不便反复操作以及时评估病情和治疗效果，极大限制了其在临床的应用。近年来，随着生物医药技术的发展，国内外学者提出了一些与igan相关的生物标志物，单独或联合检测其在血清和尿液中的表达水平可能有助于igan的诊断和评估。然而，这些生物标志物在临床实践中的灵敏度和特异性仍需被进一步考察，更加有效的生物标志物及生物标志物组合仍需更深入的探索。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供与iga肾病诊断及预后相关的生物标志物组合物及应用，以解决上述现有技术存在的问题，实现了高灵敏度、特异性检测iga肾病，尤其是iga肾病重症。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供与iga肾病诊断及预后相关的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包括细胞因子fcar、mbl和mmp-9中至少一种。
7.优选的是，所述生物标志物组合物由细胞因子fcar、mbl和mmp-9组成。
8.本发明还提供一种用于诊断iga肾病和/或评估iga肾病预后的产品，所述产品包括用于检测所述生物标志物组合物的表达水平的试剂。
9.优选的是，采用如下公式计算所述生物标志物表达水平的得分：m＝0.17*fcar-4.684*mbl-0.162*mmp-9+8.834；其中，m表示生物标志物组合物的表达水平，pg/ml；fcar、mbl和mmp-9分别表示各自的浓度，pg/ml；8.834，是用logistic回归模型计算出公式里的一个常数，根据模型的结果重症igan的概率p＝em/1+em。
10.优选的是，所述产品包括蛋白芯片或试剂盒。
11.本发明还提供检测所述的生物标志物组合物的试剂在制备辅助诊断iga肾病和/或评估iga肾病预后的产品中的应用。
12.优选的是，所述iga肾病包括iga肾病重症；所述产品包括蛋白芯片或试剂盒。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.本发明经过筛选和分析发现血液生物标志物尿液fcar、mbl、mmp-9和诊断igan相关，尤其是与重度igan的诊断密切相关；当联合检测尿液fcar、mbl和mmp-9时，对识别重度igan的auc达到了0.9902，提示尿液fcar、mbl、mmp-9联合检测可用于igan的诊断。本发明还以蛋白芯片为例，制备igan诊断的蛋白芯片验证了联合尿液fcar、mbl和mmp-9的灵敏度和特异性，本发明联合使用上述三个生物标志物检测igan具有操作无创、方便、快捷的优势，具有良好的可推广性和实际应用价值。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为血清生物标志物蛋白芯片检测后的差异表达蛋白筛选及生信分析结果；a：轻症igan与正常对照中血清生物标志物的浓度及层次聚类热图；b：重症igan与正常对照中血清生物标志物的浓度及层次聚类热图；c：轻症igan与重症igan中血清生物标志物的浓度及层次聚类热图；d：图1a与图1b中差异表达标志物的交集(fcar、mbl、mmp-9)；
17.图2为图1d中交集差异表达标志物的go及kegg分析；
18.图3为血清fcar、mbl、mmp-9进行单独和联合检测的roc曲线；a：fcar；b：mbl；c：mmp-9；d：fcar、mbl、mmp-9联合；e：灵敏度检测；f：特异性检测。
具体实施方式
19.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
20.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
21.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
22.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
23.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
24.实施例1与igan诊断相关的生物标志物筛选
25.1、筛选生物标志物的标准
26.(1)本实施例以pubmed(1966-2020.10),embase(1966-2020.10)，google scholar，cochrane library databases中的文献为检索对象，初步筛选可能与igan诊断及预后相关的细胞因子及蛋白。
27.通过上述初步筛选确定了20个与igan诊断及预后相关的细胞因子及蛋白(见表1)。
28.表1候选生物标志物
29.[0030][0031]
(2)根据表1的筛选结果，再利用如下标准进一步筛选。
[0032]
筛选标准：1)血清中稳定可测；2)能利用蛋白芯片法检测以达到方便快捷，降低成本的目的；3)研究的纽卡斯尔-渥太华量表(the newcastle-ottawa scale，nos)质量评分大于等于6分。
[0033]
经过进一步筛选，筛选得到9个应用价值较高的候选生物标志物，即fcar、mbl、mmp-7、mmp-9，il-6、mcp-1、tgf-β1、egf以及fgf-23。
[0034]
实施例2蛋白生物芯片验证生物标志物的作用
[0035]
1、样本
[0036]
从浙江大学附属第一医院肾脏病中心收集16例轻症igan及16例重症igan患者的血液样本，其igan的诊断均由肾活检证实，轻症为肾活检lee分级i、ii级，重症为肾活检lee分级大于等于iii级。同时收集16例健康人的血液样本作为对照。样品信息见表2。将血液样本离心取上层血清。上述样本收集均通过患者同意授权。
[0037]
表2临床样本信息
[0038][0039]
2、实验方法
[0040]
采用raybio公司qah-cust芯片(custom arrays，cat no:qah-cust-9，raybiotech co，norcross ga，usa)检测9种生物标志物在血清和尿液中的含量。
[0041]
将上步收集的样本(血清2倍稀释上样，尿液原液上样)加入蛋白芯片中4℃过夜孵育。洗涤之后加入检测抗体混合物，室温孵育2h。洗涤之后，加入cy3-链霉亲和素(cy3-conjugated streptavidin)到蛋白芯片上，避光孵育2h。清洗后，用innoscan 300激光扫描仪(innopsys,parc d'activit
é
s activestre,31390 carbonne-france)扫描芯片，然后用raybiotech公司qah-cust的数据分析软件来进行数据分析：
[0042]
(1)原始数据的处理及表达差异标志物的筛选
[0043]
用raybiotech软件芯片将扫描得到的原始数据进行芯片背景去除、芯片间归一化处理。在r/bioconductor中利用limma数据包进行moderated t-statistics分析，采用adjust p value(bh方法校正后p值)(或p value)和logfc(表达差异倍数，以2为底)对差异蛋白进行筛选，挑选条件为：logfc》log2(1.2)，校正后p值(或p value)《0.05，结果图表3-表5。
[0044]
表3轻症igan与正常对照中血清生物标志物的浓度
[0045][0046]
*差异表达标志物。
[0047]
表4重症igan与正常对照中血清生物标志物的浓度
[0048][0049]
*差异表达标志物。
[0050]
表5轻症igan与重症igan中血清生物标志物的浓度
[0051]
[0052][0053]
*差异表达标志物。
[0054]
(2)聚类热图
[0055]
在r/bioconductor中利用gplots数据包，采用heatmap.2函数分析。两个样本间的距离计算为欧氏距离(euclidean)；两个cluster间的距离计算为最远邻方法(complete)，定义类间距离为两类之间数据的最大距离。
[0056]
(3)差异基因go富集分析及kegg pathway富集分析
[0057]
在r/bioconductor中利用clusterprofiler数据包，采用fisher精确检验分析，挑选的标准是落在某个term/go上差异的蛋白数目》＝2，p_value《0.05，画图中取得term/go是按照count的值从大小降序排列，取前10个结果。
[0058]
血清生物标志物分析结果如图1-图2所示。取健康vs重症及轻症vs重症组差异表达生物标志物的交集，进一步筛选出3个将健康对照与不同程度igan显著区分开的生物标志物，即血清fcar、mbl、mmp-9。
[0059]
3、roc曲线确定生物标志物及其组合对igan的诊断价值
[0060]
绘制上述3个生物标志物单独及联合检测时的roc曲线，根据蛋白芯片测得的血清标志物浓度，构建logistic回归模型，绘制上述3个标志物单独及联合检测时roc曲线，计算其roc曲线下面积，评估其诊断价值，具体结果如图3所示。
[0061]
结果显示，联合检测血液生物标志物fcar、mbl、mmp-9对于igan尤其是重度igan的检测有着良好的灵敏度和特异性。在检测重度igan时，这3个血液生物标志物联合得分＝0.17*fcar浓度(pg/ml)-4.684*mbl浓度(ng/ml)-0.162*mmp-9浓度(ng/ml)+8.834。其auc达到了0.9902。当联合得分的界值为0.025时，检测的敏感度为93.75％，特异度为96.88％，表明这个生物标志物组合具有极高的重症igan检测价值。与之相比，单独检测血液fcar、mbl、mmp-9鉴别重症igan的auc为0.6865、0.9473、0.9199，均低于三种标志物联合检测。
[0062]
目前，igan的临床上的诊断和预后仍基于肾活检，但其有创性和可能带来的并发症限制了其在临床及时有效的应用。一些传统的指标也有助于评估igan的严重程度，如蛋白尿、血压和活检时估计的肾小球滤过率(egfr)。尽管侵袭性很小，但它们都是非特异性的，无法提供潜在的病理生理信息，从而改善个性化治疗的选择。近年来发现的一些新型生物标志物，也因其特异性和敏感性不够理想，无法代替有创肾活检。本发明所发现的血清生物标志物组合为igan，尤其是重度igan的临床无创诊断提供了可能。综合以上结果，本发明通过文献复习和初步统计分析，并在临床样本中进一步验证，确定了新的无创诊断igan的生物标志物联合检测方法，且通过roc曲线分析发现其具有良好的灵敏度和特异性，可应用于制备igan诊断的蛋白芯片。同时，这些生物标志物联合适应还可以应用到商业试剂盒等产品上。
[0063]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。