一种正气片浸膏中多种成分含量的测定方法与流程

1.本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种正气片浸膏中多种成分含量的测定方法，具体涉及一种正气片浸膏中4种成分：甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚含量的uplc检测方法。


背景技术：

[0002][0003]
正气片由广藿香油、紫苏叶油、木香、苍术、甘草、茯苓、陈皮、制半夏、姜厚朴、生姜等10味药组成，已收载入2020版《中华人民共和国药典》一部。而正气片浸膏作为正气片中间体，由甘草、茯苓、陈皮、制半夏、姜厚朴、生姜等六味药水煎浓缩而成，目前正气片浸膏缺少含量测定方法，给生产质量控制造成了诸多不便。


技术实现要素：

[0004]
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种正气片浸膏中多种成分含量的测定方法，用于解决现有技术中缺乏通过对正气片浸膏中多种成分的含量进行测定，从而对正气片浸膏的质量进行有效控制的问题。
[0005]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种正气片浸膏中多种成分含量的测定方法，包括：将正气片浸膏加入溶剂溶解后超声提取、过滤，获得的供试品溶液采用超高效液相色谱法(uplc)进行检测，确定供试品溶液中4种指标成分：甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量。
[0006]
较佳地，所述甘草苷的cas号为551-15-5，橙皮苷的cas号为520-26-3，和厚朴酚的 cas号为35354-74-6，厚朴酚的cas号为528-43-8。
[0007]
所述正气片浸膏与正气片的制备工艺明显不同。具体来说，正气片浸膏是由甘草，茯苓，陈皮，制半夏，姜厚朴和生姜加水煎煮两次，第一次8倍量水煎煮3小时，第二次6倍量水煎煮2小时，煎煮液过滤，减压浓缩相对密度1.03-1.05(50-70℃)后所获得的浸膏。正气片是由正气片粉(木香，苍术，甘草，蔗糖粉碎混合物)，紫苏叶油和广藿香油经流化床干燥制粒机制成正气片颗粒，加入滑石粉压制成。
[0008]
所述正气片浸膏做为正气片中间体，由甘草、茯苓、陈皮、制半夏、姜厚朴、生姜等六味药水煎浓缩而成。现代药理研究表明，厚朴酚与和厚朴酚是中药厚朴的主要成分，具强烈的中枢抑制作用；橙皮苷代表了陈皮中主要化学成分黄酮类成分，具有抗休克、抗动脉硬化、疏肝利胆、抗过敏及抗菌等作用；甘草苷代表了甘草中主要化学成分黄酮类化合物，具有抗感染、抗病毒等作用。故本发明选择甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚作为正气片浸膏的指标成分。
[0009]
较佳地，所述溶剂为甲醇。
[0010]
较佳地，所述正气片浸膏加入的质量g与溶剂加入的体积ml之比为1:15～25，优选为 1:20。
[0011]
较佳地，所述超声提取的时间为20～40分钟，优选为30分钟。
[0012]
较佳地，所述超声提取的功率为200～300w，优选为250w；所述超声提取的频率为 30～50khz，优选为40khz。
[0013]
较佳地，所述超声提取前控制超声仪中水温≤30℃，所述超声提取后控制超声仪中水温≤45℃。
[0014]
较佳地，所述超声提取后要进去冷却。所述冷却至室温，所述室温为20-30℃。
[0015]
较佳地，所述过滤为取上清液过滤膜，放弃初滤液后，取续滤液。
[0016]
优选地，所述滤膜为0.22μm滤膜。
[0017]
较佳地，所述采用超高效液相色谱法(uplc)进行检测，包括以下步骤：
[0018]
1)配制对照品溶液：将甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的对照品，加入溶剂溶解并定容，配成对照品溶液；
[0019]
2)样品检测：采用超高效液相色谱法(uplc)分别检测供试品溶液和步骤1)中的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，确定供试品溶液中甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量。
[0020]
优选地，步骤1)中，所述对照品溶液要摇匀、滤过，取续滤液。
[0021]
优选地，步骤1)中，所述对照品溶液采用逐级稀释制得。
[0022]
优选地，步骤1)中，所述对照品溶液中甘草苷的含量范围为0.90～45.22μg/ml，橙皮苷的含量范围为4.75～237.61μg/ml，和厚朴酚的含量范围为0.99～49.60μg/ml、厚朴酚的含量范围为0.91～45.40μg/ml。
[0023]
更优选地，所述对照品溶液中甘草苷的含量范围为8μg/ml，橙皮苷的含量范围为80μg/ml，和厚朴酚的含量范围为8μg/ml、厚朴酚的含量范围为8μg/ml。
[0024]
优选地，步骤1)中，所述溶剂为甲醇。
[0025]
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法(uplc)中，检测器为二极管阵列检测器 (dad)。
[0026]
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中的色谱柱为c18色谱柱。
[0027]
更优选地，所述超高效液相色谱法中的色谱柱为watersacquity uplc beh c18色谱柱 (柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm)。
[0028]
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中的检测波长为220～230nm。更优选地，所述检测波长为225nm。
[0029]
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中柱温为30～50℃。更优选地，所述超高效液相色谱法中柱温为40℃。
[0030]
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中的流速为0.1～0.3ml/min。更优选地，所述超高效液相色谱法中的流速为0.2ml/min。
[0031]
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中的进样量为0.5～5μl。更优选地，所述超高效液相色谱法中的进样量为1μl。
[0032]
优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.05～0.15％磷酸水溶液，其中，a相为乙腈，b相为0.05～0.15％磷酸水溶液；分析时间为34min；梯度洗脱。更优选地，所述超高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.10％磷酸水溶液，其中，a相为乙腈，b相为0.10％磷酸水溶液；分析时间为34min；梯度洗脱。
[0033]
上述0.05～0.15％磷酸水溶液为体积百分数为0.05～0.15％的磷酸水溶液。上述0.10％磷酸水溶液为体积百分数为0.10的磷酸水溶液。
[0034]
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序见表1，为：
[0035]
0～5min，a相：b相体积比为17：83-17：83；
[0036]
5～7min，a相：b相体积比为17：83-20：80；
[0037]
7～11min，a相：b相体积比为20：80-40：60；
[0038]
11～12min，a相：b相体积比为40：60-55：45；
[0039]
12～22min，a相：b相体积比为55：45-58：42；
[0040]
22～23min，a相：b相体积比为58：42-95：5；
[0041]
23～28min，a相：b相体积比为95：5-95：5；
[0042]
28～29min，a相：b相体积比为95：5-17：83；
[0043]
29～34min，a相：b相体积比为17：83-17：83。
[0044]
本测定方法的分析时间为34min非常短，能够快速测定正气片浸膏中的多种成分，且在前20分钟4种成分已检出，不仅节约了试剂，还可以大大减少了qc日常检测工作。
[0045]
表1
[0046][0047]
优选地，步骤2)中，所述外标法包括以下步骤：
[0048]
a)按步骤1)制备一系列不同浓度的对照品溶液，分别进行uplc检测，获得甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的色谱峰面积与对应甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的标准工作曲线的回归方程；
[0049]
b)将供试品溶液进行uplc检测，将获得的甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的色谱峰面积，代入步骤a)中相应的甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量。
[0050]
更优选地，所述标准工作曲线中，以甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的色谱峰面积为纵坐标(y轴)，其相应甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量(即浓度)为横坐标(x 轴)。
[0051]
本发明第二方面提供一种正气片浸膏中多种成分含量的测定方法在正气片浸膏的质量检测中的用途。
[0052]
如上所述，本发明提供的一种正气片浸膏中多种成分含量的测定方法，采用优化条件的前处理和仪器检测方法，对正气片浸膏中4种活性成分：甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚进行准确的定量定性检测。该种方法可以在较短的分析时间，对正气片浸膏中4种活性成分：甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚进行分离、测定。该种方法操作简单，便于控制，所测定的4种成分的标准曲线在各自范围内线性关系良好，重复性良好、精密度良好、准确度高、稳定性好，可用于多批次样品数据积累，制定合理的含量限度，保证生产稳定和临床疗效。
附图说明
[0053]
图1显示为本发明中甘草苷的专属性考察色谱图。
[0054]
图2显示为本发明中橙皮苷的专属性考察色谱图。
[0055]
图3显示为本发明中和厚朴酚和厚朴酚的专属性考察色谱图。
具体实施方式
[0056]
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0057]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0058]
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
[0059]
1、试剂
[0060]
正气片浸膏25批(批号s1-210102、s2-210103、s3-210104、s4-210106、s5-210107、 s6-210108、s7-210109、s8-210201、s9-210202、s10-210702、s11-210703、s12-210901、 s13-210902、s14-210903、s15-220601、s16-220602、s17-220603、s151-220708，上海和黄药业有限公司制备)；阴性样品(缺甘草正气片浸膏、缺陈皮正气片浸膏和缺厚朴正气片浸膏)均由上海和黄药业有限公司提供。
[0061]
对照品：甘草苷(批号111610-201908，质量分数95％)、橙皮苷(批号110721-201818，质量分数96.2％)、和厚朴酚(批号110730-201915，质量分数99.8％)、厚朴酚(批号 110729-201513，质量分数98.8％99％)，以上对照品均购自中国食品药品检定研究院。
[0062]
试剂：甲醇(分析纯ar，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，美国tedia公司)；磷酸(色谱纯，美国tedia公司)；超纯水由milli-q超纯水处理系统制备。
[0063]
2、仪器
[0064]
waters acquity uplc h-class超高效液相色谱仪(配有empower 3色谱工作站、四元超高压溶剂管理器、自动进样样品管理器、柱温箱、pdaeλ检测器，美国waters公司)； sb-5200dtd型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；al204和xs205型分析电子天平(梅特勒-托利多mettler toledo仪器上海有限公司)；milli-qadvantage a10 超纯水系统(德国默克密理博公司)。
[0065]
实施例1
[0066]
1、供试品溶液的制备
[0067]
取正气片浸膏样品1.0g，精密称定，置于50ml的离心管中，精密加入甲醇20ml，超声提取(250w，40khz)30分钟，超声前水温不能超过30℃，超声后水温基本不高于45℃。放冷，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液1#。
[0068]
2、对照品溶液的制备
[0069]
取甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的对照品，精密称定，加甲醇溶于100ml容量瓶中定容，配成对照品储备溶液。对照品储备溶液置于4℃冰箱避光保存。
[0070]
再将对照品储备溶液采用甲醇逐级稀释并定容，配成一系列不同浓度的对照品溶液。一系列不同浓度的对照品溶液中，甘草苷的含量范围为0.90～45.22μg/ml，橙皮苷的含量范围为 4.75～237.61μg/ml，和厚朴酚的含量范围为0.99～49.60μg/ml、厚朴酚的含量范围为 0.91～45.40μg/ml。对照品溶液还要摇匀、滤过，取续滤液。
[0071]
3、测定
[0072]
采用超高效液相色谱法(uplc)分别检测供试品溶液1#和一系列不同浓度的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量。即将一系列不同浓度的对照品溶液分别进行uplc检测，获得甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的色谱峰面积与对应甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的浓度之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液1#进行uplc 检测，将获得的甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的色谱峰面积，代入相应的甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液1#中甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的浓度。
[0073]
其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：
[0074]
检测器为二极管阵列检测器(dad)；色谱柱为watersacquity uplc beh c18色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm)；检测波长为225nm；柱温为40℃；流速为0.2ml/min；进样量为1μl；流动相为乙腈-0.10％磷酸水溶液，其中，a相为乙腈，b相为 0.10％磷酸水溶液；分析时间为34min；梯度洗脱。
[0075]
梯度洗脱的具体程序为：
[0076]
0～5min，a相：b相体积比为17：83-17：83；
[0077]
5～7min，a相：b相体积比为17：83-20：80；
[0078]
7～11min，a相：b相体积比为20：80-40：60；
[0079]
11～12min，a相：b相体积比为40：60-55：45；
[0080]
12～22min，a相：b相体积比为55：45-58：42；
[0081]
22～23min，a相：b相体积比为58：42-95：5；
[0082]
23～28min，a相：b相体积比为95：5-95：5；
[0083]
28～29min，a相：b相体积比为95：5-17：83；
[0084]
29～34min，a相：b相体积比为17：83-17：83。
[0085]
实施例2
[0086]
1、供试品溶液的制备
[0087]
取正气片浸膏样品1.0g，精密称定，置于50ml的离心管中，精密加入甲醇15ml，超声提取(240w，35khz)40分钟，超声前水温不能超过30℃，超声后水温基本不高于45℃。放
冷，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液2#。
[0088]
2、对照品溶液的制备
[0089]
取甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的对照品，精密称定，加甲醇溶于100ml容量瓶中定容，配成对照品储备溶液。对照品储备溶液置于4℃冰箱避光保存。再将对照品储备溶液采用甲醇逐级稀释并定容，配成一系列不同浓度的对照品溶液。
[0090]
一系列不同浓度的对照品溶液中，甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的浓度范围同实施例1中步骤2。
[0091]
3、测定
[0092]
采用超高效液相色谱法(uplc)分别检测供试品溶液2#和一系列不同浓度的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，得到供试品溶液2#中甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的浓度。具体定量过程同实施例1中步骤3。
[0093]
其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：
[0094]
检测器为二极管阵列检测器(dad)；色谱柱为watersacquity uplc beh c18色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm)；检测波长为220nm；柱温为35℃；流速为0.1ml/min；进样量为0.5μl；流动相为乙腈-0.15％磷酸水溶液，其中，a相为乙腈，b相为0.15％磷酸水溶液；分析时间为34min；梯度洗脱。
[0095]
梯度洗脱的具体程序同实施例1中步骤3。
[0096]
实施例3
[0097]
1、供试品溶液的制备
[0098]
取正气片浸膏样品1.0g，精密称定，置于50ml的离心管中，精密加入甲醇25ml，超声提取(260w，45khz)20分钟，超声前水温不能超过30℃，超声后水温基本不高于45℃。放冷，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液3#。
[0099]
2、对照品溶液的制备
[0100]
取甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的对照品，精密称定，加甲醇溶于100ml容量瓶中定容，配成对照品储备溶液。对照品储备溶液置于4℃冰箱避光保存。再将对照品储备溶液采用甲醇逐级稀释并定容，配成一系列不同浓度的对照品溶液。
[0101]
一系列不同浓度的对照品溶液中，甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的浓度范围同实施例1中步骤2。
[0102]
3、测定
[0103]
采用超高效液相色谱法(uplc)分别检测供试品溶液3#和一系列不同浓度的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，得到供试品溶液3#中甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的浓度。具体定量过程同实施例1中步骤3。
[0104]
其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：
[0105]
检测器为二极管阵列检测器(dad)；色谱柱为watersacquity uplc beh c18色谱柱(柱长为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为1.7μm)；检测波长为230nm；柱温为45℃；流速为0.3ml/min；进样量为2μl；流动相为乙腈-0.05％磷酸水溶液，其中，a相为乙腈，b相为 0.05％磷酸水溶液；分析时间为34min；梯度洗脱。
[0106]
梯度洗脱的具体程序同实施例1中步骤3。
[0107]
实施例4
[0108]
取正气片浸膏样品，采用实施例1中步骤1配制供试品溶液。同时，分别取除去甘草、陈皮、厚朴的正气片浸膏缺味阴性样品，采用实施例1中步骤1配制阴性供试品溶液。另外，按实施例1中的步骤2中配制对照品溶液，对照品溶液中，甘草苷的含量范围为8μg/ml，橙皮苷的含量范围为80μg/ml，和厚朴酚的含量范围为8μg/ml、厚朴酚的含量范围为8μg/ml。
[0109]
将上述供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液分别按实施例1中步骤3进行测定，比较保留时间进行定性，具体测试结果见图1、2、3。由图1、2、3可知，阴性样品的4个色谱峰对供试品无干扰，方法专属性良好。
[0110]
实施例5
[0111]
对本发明的正气片浸膏样品中甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的检测方法进行方法学验证，其性能指标结果如下。
[0112]
1、线性关系
[0113]
精密称取甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的对照品适量，按实施例1中步骤2加入甲醇配成一系列不同浓度的对照品溶液。按实施例1中步骤3的色谱条件，精密吸取1μl对照品溶液注入超高效液相色谱仪，以对照品浓度为横坐标(x轴)，以各指标成分的峰面积为纵坐标(y轴)，绘制标准曲线，并使定量限s/n≥10、检测限s/n≥3，计算获得甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的标准回归方程、相关系数、线性范围、定量限、检测限，具体结果见表2。
[0114]
根据表2可知，4个指标成分在各自进样质量浓度范围内线性关系良好，说明本发明方法线性范围广，准确度高。
[0115]
表2
[0116][0117]
2、稳定性
[0118]
取批号210901的正气片浸膏样品，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例 1中步骤3的色谱条件，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h进样分析，记录甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的色谱峰面积数据。结果表明，甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的色谱峰面积在24h内的rsd均小于1.71％，表明供试品溶液在24h内检测对结果无影响，稳定性良好。
[0119]
3、精密度
[0120]
取实施例1中步骤2配制的任一对照品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别连续进样分析6次，记录甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积数据。结果表明，4个成分连续6次进样的峰面积rsd均小于0.24％，表明仪器精密度良好。
[0121]
4、重复性
[0122]
取批号210901的正气片浸膏样品，精密称定6份，按实施例1中步骤1平行制备获得6 份供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件进行测定，记录甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积数据，计算含量。结果表明，4个指标成分的含量rsd均小于0.91％，表明方法重复性良好。
[0123]
5、加标回收率
[0124]
称取9份已知浓度的正气片浸膏样品(批号210901)，精密称定，分别加入低、中、高3 个质量浓度的实施例1中步骤2配制的任一对照品溶液(分别相当于原有质量分数的50％、 100％、150％)，每一质量浓度取3份，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例1中步骤3的色谱条件，分别进样分析，根据测得量和加入量计算各成分的加样回收率和 rsd，结果见表3。由表3可知，4个成分的平均回收率为98.72～99.70％，rsd为0.97～1.92％，表明方法的准确度良好。
[0125]
表3加标回收试验结果(n＝3)
[0126][0127]
[0128]
实施例6
[0129]
取不同批号的正气片浸膏样品25批，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例1中步骤3的色谱条件，分别进样分析，分别计算甘草苷、橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚的含量，结果见表4。
[0130]
由表4可知，采用建立的正气片浸膏含量测定方法，共测定了14批2021年正气片浸膏， 11批2022年正气片浸膏，共计25批，从结果来看，4种成分中甘草苷、橙皮苷两年无显著性差异，但和厚朴酚、厚朴酚的两个成分含量差异大，说明姜厚朴药材对正气片浸膏的影响较大，后续生产需注意姜厚朴药材的采购。
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表4样品含量测定结果
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与2021年比较，
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综上所述，本发明提供的一种正气片浸膏中多种成分含量的测定方法，线性关系良好，重复性良好、精密度良好、准确度高、稳定性好，可用于多批次样品数据积累，制定合理的含量限度，保证生产稳定和临床疗效。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
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上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因
此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。