同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器

1.本发明属于核心电子产业技术领域，涉及同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.据发明人研究了解，电化学发光(ecl)结合共振能量转移(ret)的方法涉及一对ecl光团之间或光团与中间试剂之间的能量转移。然而，一些ecl-ret系统供体和受体难以实现的足够的光谱重叠，不能实现理想的能量转移，同时能量可调材料的缺乏，限制了其开发应用。基于共反应物竞争策略通过触发双电位分辨ecl发射器的反向信号进行检测，通常应用h2o2和o2作为共反应物。但由于二者在溶液中存在的不稳定性，该方法也很难实现更为便捷的应用。可实现良好的准确性、可靠性和灵敏度的内参比系统通过可辨别的ecl信号和内部基准信号从而获得目标浓度定量测定。但往往难以寻找到性能优异的内部基准物质，体系构建较为困难。而在更为简便的单发光体体系中，由于只存在一个共反应物，抗原孵育后会导致阴极阳极信号的同时上升，缺少直观的信号强度改变，造成检测的结果难以精确，阻碍了其应用。因而，需要开发一种可以通过单发光体和易获取、制备的共反应物中获得直观的发光变化的检测体系。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器，构建更为简洁、准确的单发光比率免疫传感器体系。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
6.一方面，一种同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器，包括传感电极、第二抗体生物偶联物和发光体；所述传感电极的表面附着第一抗体和第一催化成分，所述第二抗体生物偶联物由第二催化成分与第二抗体通过共价键连接形成；所述第一抗体和第二抗体均能够与待测抗原特异性结合，使得第二抗体生物偶联物通过第一抗体和第二抗体与待测抗原的特异性结合能够与传感电极连接；所述第一催化成分和第二催化成分均为金纳米颗粒与还原氧化石墨烯的复合材料，第一催化成分中的金纳米颗粒的平均粒径为12～14nm，第二催化成分中的金纳米颗粒的平均粒径为3.3～3.5nm；所述发光体为ru(bpy)
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。
7.本发明研究发现，平均粒径为3.3～3.5nm的金纳米颗粒与还原氧化石墨烯的复合材料具有中等orr催化能力，同时具有优越的阴极共反应物性能，增加阴极ecl发光，对阳极具有使其信号降低的效果；平均粒径为12～14nm金纳米颗粒与还原氧化石墨烯的复合材料具有中弱oer催化能力，同时具有优越的阳极共反应物性能，增加阳极ecl发光。
8.研究表明，本发明构建的传感器，在检测待测抗原时，随着待测抗原浓度的增加，阳极ecl强度降低，而阴极ecl强度增加，阳极与阴极ecl强度比(ia/ic)与cea的对数浓度之间存在很强的线性关系，从而实现上述目的。
9.另一方面，一种上述同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器的制备方法，包括：
10.传感电极的制备：将第一抗体在裸电极上孵育，然后滴加第二催化成分的分散液，即得；
11.第二抗体生物偶联物的制备：将第一催化成分加入至edc/nhs溶液中活化，然后加入第二抗体进行孵育即得。
12.第三方面，一种上述同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器在检测cea或制备检测cea系统中的应用。
13.第四方面，一种检测试剂盒，包括上述同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器、缓冲液。
14.本发明的有益效果为：
15.本发明利用电化学发光免疫分析方法，提出了一种简洁、准确的单发光比率免疫传感器体系。改进了当今免疫检测的共反应物难以寻找，性能不稳定等的缺陷，设计了制备过程简便，性能稳定的阴极、阳极发光优异的共反应物。同时，本发明设计体系简化改进了免疫传感器常见的复杂的设计，仅使用一种发光体，且达到直接而清晰的检测发光效果，实现了准确、可靠、直观且具有高灵敏度的检测，大大提高了ecl的检测效率。
附图说明
16.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
17.图1为本发明实施例中的免疫传感器的原理图；
18.图2为本发明实施例中的免疫传感器的发光体浓度的优化曲线；
19.图3为本发明实施例中的免疫传感器的共反应物浓度的优化曲线；
20.图4为本发明实施例中的免疫传感器的检测液ph的优化曲线；
21.图5为本发明实施例中对不同浓度的cea的ecl信号响应曲线；
22.图6为本发明实施例中阳极与阴极ecl强度比(ia/ic)的对数值与cea的对数浓度之间的线性关系图；
23.图7为本发明实施例中免疫传感器的选择性检测柱状图；
24.图8为本发明实施例中免疫传感器的稳定性表征图。
具体实施方式
25.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
26.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
27.鉴于现有电化学发光免疫检测存在共反应物难以选择、性能不稳定等缺陷，本发明提出了同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器。
28.本发明的一种典型实施方式，提供了一种同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器，包括传感电极、第二抗体生物偶联物和发光体；所述传感电极的表面附着第一抗体和第一催化成分，所述第二抗体生物偶联物由第二催化成分与第二抗体通过共价键连接形成；所述第一抗体和第二抗体均能够与待测抗原特异性结合，使得第二抗体生物偶联物通过第一抗体和第二抗体与待测抗原的特异性结合能够与传感电极连接；所述第一催化成分和第二催化成分均为金纳米颗粒与还原氧化石墨烯的复合材料，第一催化成分中的金纳米颗粒的平均粒径为12～14nm，第二催化成分中的金纳米颗粒的平均粒径为3.3～3.5nm；所述发光体为ru(bpy)
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29.在一些实施例中，传感电极表面还附着有牛血清蛋白(bsa)。能够阻断非特异性吸附，提高检测准确性和灵敏度。
30.本发明的另一种实施方式，提供了一种上述同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器的制备方法，包括：
31.传感电极的制备：将第一抗体在裸电极上孵育，然后滴加第一催化成分的分散液，即得；
32.第二抗体生物偶联物的制备：将第二催化成分加入至edc/nhs溶液中活化，然后加入第二抗体进行孵育即得。
33.在一些实施例中，第一抗体在裸电极上孵育的温度为35～40℃，孵育时间为0.5～1.5h。
34.在一些实施例中，第一抗体在裸电极上孵育后浸入至bsa溶液中浸泡，然后滴加第一催化成分的分散液。bsa溶液的浓度优选为0.5～1.5wt％。
35.在一些实施例中，加入第二抗体进行孵育的温度为3～5℃，孵育时间为8～12h。
36.在一些实施例中，加入第二抗体进行孵育后，加入bsa溶液阻断非特异性位点。
37.在一些实施例中，加入第二抗体进行孵育后，加入至edc/nhs溶液中活化。
38.在一些实施例中，将传感电极加入至待测抗原溶液中，进行孵育，清洗后，加入第二抗体生物偶联物进行孵育。
39.在一种或多种实施例中，传感电极加入至待测抗原溶液中孵育的温度为35～40℃，孵育时间为0.5～1.5h。
40.在一种或多种实施例中，加入第二抗体生物偶联物进行孵育的温度为35～40℃，孵育时间为0.5～1.5h。
41.本发明的第三种实施方式，提供了一种上述同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器在检测cea或制备检测cea系统中的应用。
42.本发明所述的应用可以以疾病的诊断与治疗为目的，也可以科学研究等以非疾病的针对治疗为目的。
43.检测过程为：将传感电极加入至待测cea溶液中孵育，清洗后加入第二抗体生物偶联物进行孵育，将孵育后的电极加入至含有发光体ru(bpy)
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的溶液中进行电化学发光检
测。
44.本发明的第四种实施方式，提供了一种检测试剂盒，包括上述同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器、缓冲液。
45.在一些实施例中，还包括超纯水。用于清洗待测抗原溶液孵育后的传感电极。
46.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
47.实施例
48.材料准备：
49.10ml 2mg/ml氧化石墨烯(go)与10ml水合肼置于搅拌器上，用大玻璃杯罩上，常温下搅拌6h，水合肼将go还原氧化石墨烯(rgo)。两组2ml 2mg/ml rgo在搅拌下加入分别加入2.5μl、7.5μl 1％的haucl4溶液。再加入硼氢化钠和柠檬酸钠作为还原剂。最终合成了两种不同粒径aunps的au/还原氧化石墨烯，即au-rgo-1(aunps平均粒径为13nm)、au-rgo-2(aunps平均粒径为3.4nm)。研究发现，具有中等orr催化能力的au/rgo-2具有优越的阴极共反应物性能，增加阴极ecl发光对阳极具有使其信号降低的效果，而具有中弱oer催化能力的au/rgo-1具有优越的阳极共反应物性能，增加阳极ecl发光。
50.同种共反应物的发光体竞争比率型双抗夹心免疫传感器的构建：
51.1.120μl au-rgo-2加入到120μl edc(0.01mol/l)/nhs(0.002mol/l)中)中加入120μl抗体2(ab2，10μg/ml，9μl ab2(detection antibody)+111μl 0.1％叠氮化钠)在4℃恒温振荡条件下10h然后进行离心操作。离心后，加入120μl1％bsa溶液，阻断非特异性位点，再在4℃条件下振荡2h，然后离心10分钟，即获得au-rgo-2-ab2(ab2生物偶联物)。
52.2.将步骤1获得的au-rgo-2-ab2用edc(0.01mol/l)/nhs(0.002mol/l)溶液在37℃下处理30min以激活au-rgo-2的羧基。用超纯水洗涤之后储存。
53.3.抗体1(ab1，10μg/ml，名称为capture antibody)在已经的打磨玻碳电极上孵育1h(37℃)。然后去除多余的试剂，用1.0wt％bsa浸泡电极以阻断非特异性吸附部位。再将在电极表面滴上au-rgo-1。
54.4.在步骤3获得的电极上加入待检测的cea溶液(5μl)，在37℃下孵育1h。用超纯水清洗后，再加入5μl步骤2制备的ab2生物偶联物孵育培养1h(37℃)，由于抗原抗体的特异性结合效应，抗体2(ab2)与抗体1(ab1)通过作为抗原的cea连接，au-rgo-2-ab2即连接到了修饰有ab1与au-rgo-1的阳极上，竞争溶液中阴阳极共同的发光体ru(bpy)
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。随着检测物cea浓度的增加，阳极ecl强度降低，而阴极ecl强度增加，阳极与阴极ecl强度比(ia/ic)与cea的对数浓度之间存在很强的线性关系，自此比率ecl免疫传感器构建完成，如图1所示。
55.检测过程为：将步骤4制好的电极放入至ecl检测仪暗盒中的发光体溶液中，即可得到ecl检测效果图像。
56.参数优化：
57.为了在cea的ecl检测中取得优异的性能，对检测液(待测cea溶液)的ph值、共反应物和发光体的浓度等多个实验参数进行了优化，结果如图2～4所示。图2-3中，可确定发光体和阴极共反应物(au-rgo-2)的最佳浓度分别为1mm和0.25mg
·
ml-1
，提高了该比率免疫传感器灵敏度。由图4确定au-rgo-1和au-rgo-2在ru(bpy)
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下同时达到最佳性能和达到最大阳极或阴极发射的最佳ph为ph＝6。
58.线性检测：
59.在最佳条件下，将不同浓度的cea孵育到免疫传感器上，研究ru(bpy)
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与aunps-rgo-2和aunps-rgo-1的阴极和阳极ecl信号。如图5所示，随着cea浓度的增加，阳极ecl强度降低，而阴极ecl强度增加。在1fg/ml～1ng/ml范围内，图6显示出阳极与阴极ecl强度比(ia/ic)与cea的对数浓度之间存在很强的线性关系。回归方程为ig(ia/ic)＝-0.26lgc-1.43(ng/ml)，相关系数为r2＝0.9995。因此，该cea的免疫传感器具有优异的分析性能，检测限(lod)为0.33fg/ml(s/n＝3)。
60.选择、稳定、真实样本：
61.为评价该复合免疫传感器的选择性，选择其他tms(egfr2、era和mhp22，浓度为10-2
ng/ml)分别作为干扰物质。如图7所示，与cea明显的ecl强度相比，egfr2、era和mhp22的ecl强度非常弱，这体现了优越的选择性。
62.目前的免疫传感器对cea检测具有良好的特异性。在1pg/ml he4的条件下，本实施例还对ecl比率策略进行了10个循环的稳定性评估，如图8所示。阴极发射和阳极发射的rsd分别为0.18％和0.48％，表明免疫传感器具有良好的稳定性。
63.为了评价所构建的免疫传感器在真实样品中的适用性和可靠性，采用标准添加法对人血清样品进行了检测。如表1所示，使用含有0.1fg/ml和10fg/ml标准浓度的人血清样品对回收率进行检测，得到100.7％到106.7％的回收率，rsd值小于5.9％，说明了免疫传感器在实际应用中的可行性。
64.表1检测真是样品的回收率和rsd
[0065][0066]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。