用于检测食源性致病菌的长余辉免疫层析试纸及其制备方法

本发明涉及一种用于检测食源性致病菌的长余辉免疫层析试纸及其制备方法，属于生物工程领域。

背景技术：

1、近年来，由食源性微生物引起的疾病已成为危害人类健康的头号杀手。传统平板法需要经过细菌培养、分离与鉴别、生化分析和血清学鉴定等过程，检测结果较为准确，但操作繁琐且耗时长(4-7d)，难以有效预防和控制食源性致病菌疾病的暴发。目前，已经建立了许多快速检测方法，但是在实际应用中，大部分方法仍然需要在灵敏度和特异性两方面进行改进。免疫学检测技术检测迅速、操作简便，但灵敏度有待提高。分子生物学技术灵敏度和特异性相对较高，但其对操作人员和操作环境的要求高并需要特定的检测仪器。生物传感器检测技术可用于检测致病菌及其产生的毒素，样品不需要预增菌，但设备复杂，不易推广。代谢学检测技术具有快速、简便的优点，但其需要大量的数据支撑以建立相应的数学模型，并且易受环境因素的影响而导致结果的一致性较差。

2、免疫层析试纸具有检测快速、操作简单、成本低、易于保存，适合于现场筛查等优点。我国食品企业数量庞大，但检测条件有限、检测量巨大，其它分子、免疫学检测实施困难等现实，免疫层析试纸技术是现阶段我国最具普及推广价值的快速检测技术之一。

3、长余辉纳米材料(plnps：persistentluminescent nanoparticles)是一种被能量(γ射线、x射线、紫外光、可见光和电子束等)激发后可产生可见光或者近红外区域长时间发光的特殊纳米材料，可以通过改变合成条件和元素组成，对其光谱发射区域进行调控，使其发出不同颜色的光。近年来，plnps的应用已经从最初的民用，即装饰、安全显示器、刻度盘等，延伸到各种先进的科学领域，如生物医学、临床医学、生命科学以及能源和环境工程。plnps具有其它荧光标记材料所不具备的优点如发光寿命长，发光强度大，毒性较低，表面修饰之后更适用于活体生物的体内研究；光化学稳定性较好，可以避免光漂白现象的发生，可以体外激发进行光学成像，有效地避免生物体的自发光和激发光源的背景光对成像效果的影响，近几年作为新型荧光探针也开始应用于生物荧光标记领域。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于检测食源性致病菌的长余辉免疫层析试纸及其制备方法，解决了检测食品中食源性致病菌方法灵敏度不高、检测时间长、检测过程复杂的技术问题。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、用于检测食源性致病菌的长余辉免疫层析试纸，包括支撑层，所述支撑层上设有吸附层，所述吸附层从测试端依次为吸附纤维层、长余辉抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，所述吸附纤维层、长余辉抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层中相邻层相互衔接，在纤维素膜层上设有检测线和质控线，所述检测线由抗食源性致病菌的单克隆抗体或多克隆抗体构成，所述质控线由羊抗或兔抗小鼠igg抗体、或羊抗兔igg抗体构成，所述长余辉抗体纤维层上吸附有长余辉抗体，所述的长余辉抗体由长余辉纳米材料标记的抗食源性致病菌的单克隆抗体或多克隆抗体构成。

4、所述长余辉纳米材料为sr2mgsi2o7:eu2+,dy3+，该材料的激发峰为254nm或350nm，发射峰为470nm，余辉时长为10h，颗粒大小为直径50-200nm的纳米颗粒。

5、所述长余辉纳米材料sr2mgsi2o7:eu2+,dy3+的标记方法为：

6、将表面经氨基化修饰的sr2mgsi2o7:eu2+,dy3+纳米材料用pbs缓冲溶液分散，向其中加入质量浓度25％的戊二醛溶液，室温反应3小时，离心洗去多余的戊二醛，然后将反应液分散在pbs缓冲溶液中，加入食源性致病菌单克隆抗体或多克隆抗体，4℃反应3小时，经离心洗涤，即得标记的长余辉抗体，置于pbs缓冲溶液中，4℃保存。

7、所述sr2mgsi2o7:eu2+,dy3+纳米材料的氨基化修饰方法为：

8、在研磨sr2mgsi2o7:eu2+,dy3+纳米材料的同时，不断加入naoh溶液，将sr2mgsi2o7:eu2+,dy3+纳米材料超声分散在naoh溶液中，经反复洗涤后分离，得到表面含有羟基的纳米颗粒ho-plnps；

9、将ho-plnps超声分散在pvp溶液中，静止后分离并提取上清液，离心得到被pvp包裹的纳米粒子pvp-plnps；

10、将pvp-plnps分散在乙醇和超纯水的混合溶液中，加入氨水，混合后超声分散；待溶液混合均匀后将溶液置于冰水浴中，缓慢滴加正硅酸乙酯；连续搅拌，通过反复离心和洗涤获得sio2-plnps；最后加入改性剂aptes改性，生成氨基化的sr2mgsi2o7:eu2+,dy3+纳米材料。

11、所述的检测食源性致病菌的长余辉免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：

12、(1)制备食源性致病菌单克隆抗体或多克隆抗体；

13、(2)制备长余辉抗体；

14、(3)制备吸附纤维层，所述吸附纤维层采用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；

15、(4)制备长余辉抗体纤维层；

16、(5)制备纤维素膜层，所述纤维素膜层采用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，用点样仪在纤维素膜上喷点检测印迹，烘干后备用；

17、(6)组装试纸，将吸附纤维层、长余辉抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层依次贴在带有粘合剂的支撑层上，将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸。

18、所述吸附纤维层的制备方法为：将玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜浸入tbs缓冲溶液中，以浸湿为准，冻干，备用；所述tbs缓冲溶液的浓度为0.01m，ph为7.8；按质量百分比浓度计，所述tbs缓冲溶液中还含有0.5％pvp、1％蔗糖、0.5％吐温-20、1％bsa。

19、所述的检测食源性致病菌的长余辉免疫层析试纸的检测方法，包括以下步骤：

20、(1)样品前增菌：在增菌培养基中加入包裹有长余辉纳米材料的脂质体溶液，再加入样品进行增菌培养；

21、(2)试纸检测：将试纸插入样品溶液，10～20秒后拿出平放，5～10min后通过观察检测试纸的检测线有无余辉，判断样品中是否含有食源性致病菌，或通过荧光读条仪进行半定量分析。

22、本发明有益效果：

23、(1)本发明的长余辉纳米材料被激发后，余辉时间长，在检测中无需使用荧光灯一直照射，用肉眼便可观察，同时也避免了其他荧光试纸检测过程中常见的光漂白和基质自发荧光的难题，大大提高检测试纸的准确性。

24、本发明采用的硅酸盐长余辉发光材料不仅有良好的化学稳定性和热稳定性，其主要原料(四乙氧基硅烷)丰富易得、价格低，烧结温度比铝酸盐体系低，制法简单，生产成本低。

25、(2)本发明试纸特异性强，灵敏度高。本发明将长余辉纳米材料与免疫层析技术相结合，待检样品中的目标食源性致病菌经带有包裹长余辉纳米材料脂质体的增菌培养基培养后便可发长余辉，无需任何标记流程，制作成本低，光稳定性强，将长余辉抗体引入试纸后，达到了抗原抗体双重信号放大的效果，能获得比普通胶体金试纸更高的灵敏度。该试纸条具有灵敏度高、特异性好的的优点，最低可检测1cfu/ml的痕量污染，即1cfu/ml的痕量污染样品经前增菌培养后便可检出。

26、(3)简便、快速。该试纸可对食品样品增菌处理后直接检测，在紫外光下激发2-10s，便可直接观察结果。也可借助长余辉阅读器直接读值，实现半定量检测。检测时只需将试纸插入被检样品10～20s，5-10min内即可判定检测结果，省时省力，操作简便，一步完成。

27、(4)结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示蓝色“︱”和“︱︱”印迹作为检测阴性和阳性标记，即在纤维素膜上显示一条蓝色“︱”印迹，表示被检样品中不含食源性致病菌；显示两条蓝色“︱︱”印迹，表示被检样品中含有食源性致病菌。此结果可用肉眼直接观测，判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

28、(5)节省费用。该试纸条检测时无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检测，检测费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备的投入费用。可进行定性和半定量检测，最低可检测1cfu/ml的痕量污染，成本低。

29、(6)适用范围广，便于推广应用。该试纸能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等，既适于单个样品的检测，又适于大量样品的筛查，能应用于疾病诊断、细菌检测和环境检测等领域。本发明在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要意义，具有明显的经济效益和社会效益。