一种升麻（大三叶升麻）标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法与流程

1.本发明涉及一种中药的特征图谱的构建方法，尤其涉及一种升麻（大三叶升麻）标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法，属于中药分析及质量鉴别、控制技术领域。


背景技术：

[0002] 升麻(大三叶升麻，cimicifuga heracleifolia kom.)，为升麻属植物大三叶升麻的根茎，具有发表透疹、清热解毒、升举阳气的功效；主治风热头痛、齿痛、口疮、咽喉肿痛、麻疹不透、阳毒发斑、脱肛、子宫脱垂等症。其主产于我国东北部地区，目前，市场以东三省产量最大，升麻标准汤剂是由升麻饮片经水提、浓缩、干燥等而成的冻干粉，与药材和饮片相比，已失去固有的形态，以及对应的活性成分也有相应的变化，因此仅采用药材或饮片的含量指示性成分定量分析，难以全面反映其内在质量，而目前对于升麻标准汤剂的定性检测技术几乎没有。
[0003]
特征图谱是一种体现中药化学成分整体特征的质量评价方法，对中药及其制剂的真实性、质量的一致性和稳定性均可有效地加以检测和控制。因此，有必要建立一种关于特征图谱的快速鉴定的检测技术。
[0004]
根据2016年国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》，中药标准汤剂系遵循中医药理论，采用合格饮片按照临床汤剂煎煮方式规范煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得，作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。
[0005]
标准汤剂是连接传统中药饮片和现代中药制剂的“桥梁”，为控制中药终端产品的质量提供了参照物，为标化中药不同用药形式确保质量的均一性、疗效的一致性提供了工具，为评价不同厂家产品质量的一致性提供了参照。因此，中药饮片标准汤剂质量标准的研究将为所有源于饮片水煎剂的终产品的质量标准的制定提供基础。
[0006]
根据2021年国家药典委员会发布的《160个中药配方颗粒国家药品标准》中升麻（大三叶升麻）配方颗粒中的特征图谱规律，以咖啡酸、异阿魏酸、阿魏酸等三种已知酚酸物质为对象，沿用hplc法进行升麻标准汤剂特征图谱的定性研究成为控制配方颗粒终产品质量的有效途径。


技术实现要素：

[0007]
本发明旨在解决现有技术问题，而提出了一种升麻标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法。在本技术方案中，基于高效液相色谱仪建立特征图谱，并进行特征图谱的检测，能整体控制升麻标准汤剂中的特征成分，弥补了现有质量控制技术的不足，所得特征图谱中的特征峰信息量丰富，能有效保证升麻标准汤剂的整体质量的稳定性，使升麻标准汤剂的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为升麻标准汤剂的质量鉴别及控制提供有效依据。
[0008]
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：一种升麻标准汤剂特征图谱的构建方法，包括如下步骤： a .对照品溶液的制备：取咖啡酸对照品，置棕色量瓶中，加稀乙醇，制成每1ml含咖啡酸0.1mg的溶液，即得咖啡酸对照品溶液；取异阿魏酸对照品，加稀乙醇，制成每1ml含0.1mg的溶液，即得异阿魏酸对照品；取阿魏酸对照品，加稀乙醇，制成每1ml含0.1mg的溶液，即得阿魏酸对照品； b.对照药材溶液的制备：取升麻对照药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得； c.供试品溶液的制备：取本品0.1g，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得； d.建立：分别取所得的对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪，测定，建立uhplc特征图谱；作为一种优选方案，超高效液相色谱仪内色谱条件满足：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm；色谱柱柱温：35℃；流动相：以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b；流动相流速：0.3ml/min；进样量：1μl；检测波长：320nm；理论板数按异阿魏酸峰计算应不低于5000；流动相按梯度洗脱程序为： 进一步的，所述升麻标准汤剂的uhplc特征图谱包括七个特征峰，其中，各特征峰与对照药材参照物特征峰保留时间相对应，与异阿魏酸参照物相应的峰为s峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±ꢀ
10％之内，规定值为0.515（峰1）、0.905（峰2）、1.441(峰4)、1.625（峰5）、1.765（峰6）、1.795（峰7）；一种升麻标准汤剂的质量检测方法，包括如下步骤： s1.待测供试品溶液的制备：取本品0.1g，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得； s2.检测：取经步骤s1所得的待测供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪，测定，并将所得超高效液相色谱图与所得uhplc特征图谱进行比较，检测升麻标准汤剂的质量及真伪；超高效液相色谱仪内色谱条件满足：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为
1.8μm；色谱柱柱温：35℃；流动相：以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b；流动相流速：0.3ml/min；进样量：1μl；检测波长：320nm；理论板数按异阿魏酸峰计算应不低于5000；流动相按梯度洗脱程序为：升麻标准汤剂涉及的炮制方法如下：取升麻饮片100g，加水煎煮二次，一煎加8倍水，浸泡30min，武火煮沸，保持微沸煎煮20min，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮15min，200目筛网过滤，合并水煎液，立即冷却至室温，减压浓缩，冷冻干燥，分装，即得。
[0009]
其中，所得升麻标准汤剂为棕黄色至棕褐色粉末，气微，味苦。制备工艺符合《中华人民共和国药典》2020年版一部升麻【炮制】项下的相关规定。
[0010]
采用本技术方案，带来的有益技术效果为： 1)本发明提供一种升麻标准汤剂特征图谱的构建及质量检测方法，确定了咖啡酸、异阿魏酸、阿魏酸等七个共有峰，所构建的uhplc特征图谱中色谱峰实现较好分离，特征图谱信息丰富，色谱峰形好，可以全面的反应升麻标准汤剂的主要化学成分信息，检测方法具有良好的稳定性和重复性，便于大规模推广应用； 2)本发明构建的升麻标准汤剂的uhplc特征图谱，填补了现有技术升麻标准汤剂质量控制的空白，为后续升麻配方颗粒等研究提供了有效研究基础； 3)本发明基于超高效液相色谱仪建立特征图谱，并进行特征图谱的检测，能整体控制升麻标准汤剂中的特征成分，能有效保证升麻标准汤剂的整体质量的稳定性，使升麻标准汤剂的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为中药材质量鉴别提供有效依据。 附图说明图1为实施例1中升麻标准汤剂对照特征图谱(其中，峰1：咖啡酸，峰2：阿魏酸，峰3（s）：异阿魏酸)；图2为实施例3中提取溶剂考察结果色谱图；图3为实施例3中提取方法考察结果色谱图；图4为实施例3中提取时间考察结果色谱图；图5为实施例3中溶剂加入量考察结果色谱图；图6为实施例4的波长考察中咖啡酸紫外吸收光谱图；图7为实施例4的波长考察中阿魏酸紫外吸收光谱图；图8为实施例4的波长考察中异阿魏酸紫外吸收光谱图；
图9为实施例4中升麻标准汤剂不同波长色谱图；图10为实施例4中柱温考察结果色谱图；图11为实施例4中流速考察结果色谱图；图12为实施例5中色谱峰指认结果图(其中，峰1：咖啡酸，峰2：阿魏酸，峰3(s)：异阿魏酸)； 图13为实施例5中升麻标准汤剂特征图谱(其中，s1(7)-s20(7)分别对应供试品批号：220718-01、220718-02、220718-03、220718-04、220718-05、220718-06、220718-07、220718-08、220718-09、220718-10、220718-11、220718-12、220718-13、220718-14、220718-15、220718-16、220718-17、220718-18、220718-19、220718-20。 具体实施方式下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0011]
在以下实施例中，所涉及的仪器包括：高效液相色谱仪：安捷伦1290ⅱ型高效液相色谱仪， 色谱柱：thermo acclaim rslc120-c18（1.8μm，2.1
×
100mm）、waters acquity uplc hss t3（1.8μm，2.1
×
100mm）、ultimate aq-c18（1.8μm，2.1
×
100mm），电子天平：sqp-quintix213-1cn、sqp-secura125-1cn(赛多利斯科学仪器有限公司)，超纯水机：eped-e2-30tj(南京易普易达科技发展有限公司)，超声波清洗器：cj-100st（600w,40khz;深圳市超洁科技实业有限公司）；在以下实施例中，所涉及的试剂包括：乙腈(sigma公司，色谱纯)、磷酸(分析纯)、水(超纯水)，其余试剂均为分析纯；在以下实施例中，所涉及的供试品包括： 升麻标准汤剂(冻干粉)批号： 220718-01、220718-02、220718-03、220718-04、220718-05、220718-06、220718-07、220718-08、220718-09、220718-10、220718-11、220718-12、220718-13、220718-14、220718-15、220718-16、220718-17、220718-18、220718-19、220718-20。
[0012] 在以下实施例中，所涉及的对照品包括： 咖啡酸(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，99.7%含量) 阿魏酸(中国食品药品检定研究院，批号：110773-201915，99.4含量) 异阿魏酸(中国食品药品检定研究院，批号：111698-201904，99.3%含量)。
[0013]
实施例1 一种升麻标准汤剂特征图谱的构建方法，包括如下步骤： a .对照品溶液的制备：取咖啡酸对照品，置棕色量瓶中，加稀乙醇，制成每1ml含咖啡酸0.1mg的溶液，即咖啡酸对照品溶液；取阿魏酸对照品，加稀乙醇，制成每1ml含0.1mg的溶液，即得阿魏酸对照品；取异阿魏酸对照品，加稀乙醇，制成每1ml含40μg的溶液，即得异阿魏酸对照品； b.对照药材溶液的制备：取升麻对照药材粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加入稀乙
醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得； c .供试品溶液的制备：取本品0.1g，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得； d.建立：分别取所得的对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪，测定，建立uhplc特征图谱(如图1所示)；高效液相色谱仪内色谱条件满足：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm；色谱柱柱温：35℃；流动相：以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b；流动相流速：0.3ml/min；进样量：1μl；检测波长：320nm；理论板数按异阿魏酸峰计算应不低于5000； 流动相按下表1梯度洗脱程序为：表1梯度洗脱程序 最终规定：升麻标准汤剂的特征图谱中应呈现七个特征峰，并应与对照药材特征峰保留时间相对应，与异阿魏酸参照物相应的峰为s峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±ꢀ
10％之内，规定值为0.515（峰1）、0.905（峰2）1.441(峰4)、1.625（峰5）、1.765（峰6）、1.795（峰7）； 即：升麻标准汤剂的uhplc特征图谱包括七个特征峰，其中，各特征峰与对照药材参照物特征峰保留时间相对应，与异阿魏酸参照物相应的峰为s峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±ꢀ
10％之内，规定值为0.515（峰1）、0.905（峰2）1 .441(峰4)、1.625（峰5）、1.765（峰6）、1.795（峰7）；实施例2 一种升麻标准汤剂的质量检测方法，包括如下步骤： s1 .待测供试品溶液的制备：取本品0.1g，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得； s2 .检测：取经步骤s1所得的待测供试品溶液，注入至超高效液相色谱仪，测定，并将所得超高效液相色谱图与所得uhplc特征图谱进行比较，检测升麻标准汤剂的质量及真伪；高效液相色谱仪内色谱条件满足：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为
1.8μm；色谱柱柱温：35℃；流动相：以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b；流动相流速：0.3ml/min；进样量：1μl；检测波长：320nm；理论板数按异阿魏酸峰计算应不低于5000； 流动相按下表2梯度洗脱程序为：表2梯度洗脱程序实施例3 基于实施例1-2，本实施例对供试品溶液制备中的提取溶剂、提取方法、提取时间、溶剂加入量进行考察，以本技术方案作进一步的说明。
[0014]
一、提取溶剂考察 取本品(批号：220718-1)0.1g，五份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试 品提取溶剂为乙醇25ml、稀乙醇25ml、25%乙醇25ml、甲醇25ml，50%甲醇25ml时进行考察，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用对应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得结果如图2所示。
[0015] 结果表明：当提取溶剂为稀乙醇时，色谱峰信息量大，故供试品提取溶剂确定为稀乙醇。
[0016]
二、提取方法考察取本品(批号：220718-1)0.1g，两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25ml，密塞，称定重量，分别回流处理30min、超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得结果如图3所示。
[0017] 结果表明：超声提取与回流提取时，效果一致，因超声提取操作更为简便，故，供试品提取方法确定为超声处理。
[0018]
三、提取时间考察 取本品(批号：220718-1)0.1g，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250w，频率40khz)20min、30min、45min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得结果如图4所示。
[0019] 结果表明：当提取时间为30min时，即可充分提取，故，供试品提取时间确定为30min。
[0020]
四、溶剂加入量考察 取本品(批号：220718-1)0.1g，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入稀乙醇10ml、25ml、50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，再
称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所得结果如图5所示。
[0021]
结果表明：在溶剂加入量为25ml时，特征图谱色谱峰面积适中，故，供试品溶剂加入量确定为25ml。
[0022] 综上所述，升麻标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品0 .1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0023]
实施例4基于实施例1-3，本实施例对特征图谱构建中的色谱条件(波长、柱温、流速)进行考察，以对本技术方案作进一步的说明。
[0024]
一、波长考察利用二极管阵列检测器分别对咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、供试品溶液进行全波段扫描，并提取供试品溶液在360nm、320nm、254nm波长下的色谱图，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图6-9所示。
[0025] 结果表明：在检测波长为320nm时，色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故，将检测波长确定为320nm。
[0026]
二、柱温考察 将柱温分别设定为25℃、35℃、40℃，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如下图10所示。
[0027]
结果表明：柱温为35℃时，色谱图峰形较为对称，分离度好，故，将柱温限定为35℃。
[0028]
三、流速考察 将流速分别设定为0.2ml/min、0.3ml/min、0.4ml/min，其余色谱条件同实施例1，测定，所得结果如图11所示。
[0029] 结果表明，流速分别为0.2ml/min、0.3ml/min、0.4 ml/min时，各特征峰峰形均较好，分离度适中，故，流速确定为0.3ml/min，便于进行后续考察。
[0030] 综上所述，升麻标准汤剂特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒度为1.8μm)，以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸溶液为流动相b，按下表3中的规定进行梯度洗脱，柱温为35℃，检测波长为320nm；理论板数按异阿魏酸峰计算应不低于5000。
[0031]
表3梯度洗脱程序实施例5 基于实施例1中的升麻标准汤剂的uhplc特征图谱的构建方法，本实施例还进行了如下的方法学考察，具体包括：一、色谱峰指认
ꢀ
1 .对照品溶液的制备：取咖啡酸对照品，置棕色量瓶中，加稀乙醇，制成每1ml含0.1mg的溶液，即得咖啡酸对照品溶液；取阿魏酸对照品，加稀乙醇，制成每1ml含0.1mg的溶液，即得阿魏酸对照品；取异阿魏酸对照品，加稀乙醇，制成每1ml含0.1mg的溶液，即得异阿魏酸对照品； 2 .空白对照溶液的制备：取稀乙醇25ml，置具塞锥形瓶中，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，摇匀，即得； 3 .供试品溶液的制备：取本品0.1g，置具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得； 对升麻标准汤剂特征图谱峰进行指认，所得结果如图12，其中，峰1为咖啡酸，峰2为阿魏酸，峰3(s)为异阿魏酸，在后续的方法学考察中，对供试品图谱中的七个峰进行考察。
[0032]
二、精密度试验 取升麻标准汤剂(批号：220718-1)供试品溶液，连续进样六次，计算各特征峰的保留时间及峰面积的rsd值，所得结果如下表4、表5所示。
[0033]
表4精密度考察-保留时间表5精密度考察-峰面积结果表明：该仪器精密度良好。
[0034]
三、重复性考察 精密称取升麻标准汤剂(批号：220718-1)六份，按前述的升麻标准汤剂的uhplc特征图谱的构建方法进行供试品溶液制备及测定，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰
面积的rsd值，所得结果如下表6、表7所示。
[0035]
表6重复性考察-相对保留时间表7重复性考察-相对峰面积结果表明：六份样品的相对保留时间的rsd值为0.013%
‑ꢀ
0.057％，相对峰面积rsd值为1.89%-6.17％，说明该方法重复性良好。
[0036]
四、中间精密度考察 基于前述的升麻标准汤剂的特征图谱的构建方法，由不同人员(a、b)在不同时间(t1、t2)分别精密称取升麻标准汤剂(批号：220718-1)各两份，制备供试品溶液，进行测定，结果如表8、表9所示。
[0037]
表8人员和时间考察-相对保留时间表9人员和时间考察-相对峰面积
结果表明：由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，方法稳定性较好。
[0038]
五、耐用性考察(色谱柱耐用性) 基于前述的升麻标准汤剂的特征图谱的构建方法，分别对thermo acclaim rslc120-c18（2.2μm，2.1
×
100mm）、waters acquity uplc hss t3（1.8μm，2.1
×
100mm）、ultimate aq-c18（1.8μm，2.1
×
100mm）三种色谱柱进行考察，所得结果如下表10、表11所示。
[0039]
表10色谱柱耐用性考察-相对保留时间表11色谱柱耐用性考察-相对峰面积 结果表明：用上述三种色谱柱对升麻标准汤剂供试品进行检测，特征峰相对保留时间的rsd值为0.28%-%1.58，特征峰相对峰面积的rsd值为3.97%-8.97%，表明该方法色谱柱耐用性良好。
[0040]
六、稳定性考察 基于前述的升麻标准汤剂的特征图谱的构建方法，取同一升麻标准汤剂供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、18h、24h时测定，所得结果如下表12、表13所示。
[0041]
表12稳定性考察-保留时间
表13稳定性考察-峰面积结果表明，其相对应的特征峰保留时间的rsd值为0.054％-0.42%，特征峰峰面积的rsd值为0.25％-3.20%，样品溶液在24小时内较稳定。
[0042] 综上所述：各特征峰相对保留时间的rsd在以上各项考察中均符合要求，该方法良好，并将上述七个特征峰纳入后续考察。
[0043]
七、特征峰的确定及对照图谱的建立1 .二十批升麻标准汤剂验证结果 基于前述的升麻标准汤剂的特征图谱的构建方法，对二十批升麻供试品进行特征图谱的分析，计算相对保留时间和相对峰面积，因色谱柱耐用性考察时，不同色谱柱色谱峰相对保留时间rsd最大值为5 .4％，固规定值范围定为
±ꢀ
10％，各色谱峰相对保留时间与相对峰面积分别如下表14、表15及图13所示。
[0044]
表14二十批升麻标准汤剂特征峰-相对保留时间
表15二十批升麻标准汤剂特征峰-相对峰面积
ꢀ
根据相对保留时间稳定及各批次供试品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7即合计七个耐用性较好的峰作为特征峰。
[0045] 2.相对保留时间规定值限度的制定 方法学各考察项目及验证结果汇总如下表16。
[0046]
表16方法学各项目结果rsd（％）汇总标准—相对保留时间故将各峰的相对保留时间规定值暂定为10％。
[0047] 最终规定：麻标准汤剂的特征图谱中应呈现七个特征峰，并应与对照药材特征峰保留时间相对应，与异阿魏酸参照物相应的峰为s峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±ꢀ
10％之内，规定值为0.515（峰1）、0.905（峰2）、1.441(峰4)、1.625（峰5）、1.765（峰6）、1.795（峰7）。
[0048]
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对二十批升麻标准汤剂进行合成，建立了升麻标准汤剂特征图谱的对照图谱，可较为准确地整体控制升麻标准汤剂的质量，如图1所示。