一种糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条及其制备方法与流程

1.本发明涉及医疗检测技术领域，具体为一种糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条及其制备方法。


背景技术：

2.2型糖尿病是一种以高血糖为特征的临床综合征，具有病程长、治愈难度大、反复发作等特点，需加强早期诊断、治疗。糖化血红蛋白属于人体血液中血红蛋白与葡萄糖非酶化产物，能反映机体近2～3个月平均血糖水平，且相较于空腹血糖、餐后2h血糖，其检测结果受抽血时间、空腹、饮食、胰岛素使用等干扰较小，且其浓度变化与血液中葡萄糖含量呈正相关。而机体出现糖尿病，致使血糖升高时，可引发糖化血红蛋白异常增高，加重糖脂代谢功能紊乱。
3.此外，神经内分泌系统中，下丘脑垂体-肾上腺轴为重要组成部位之一，其功能易受高血糖水平、胰岛素抵抗影响，主要体现为皮质醇增高。皮质醇属于胰岛素抵抗激素，在调节糖代谢中的作用与胰岛素相反。皮质醇可促进外周组织蛋白质分解，增加氨基酸含量，且可协同儿茶酚胺等，激活脂肪分解酶，增加脂肪分解，提升血液中游离脂肪酸、甘油含量。而游离脂肪酸、甘油可促进糖原异生，致使血糖水平升高。研究还发现，糖尿病患者体内长期高水平皮质醇是引发胰岛素分泌不足、血糖升高的关键因素。
4.在目前的现有技术中，针对糖尿病患者的检测通常是检测血糖水平或者皮质醇水平，两种检测方式均可能出现一定的误检率，可能需要多次检测才能确诊，因此导致检测效率不高。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条及其制备方法，解决了上述背景技术中提出的技术问题。
6.为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条，包括pvc底板，所述pvc底板为长条结构，所述pvc底板上依次设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述硝酸纤维素膜上依次设置有cortisol检测线、hba1c检测线和质控线；所述结合垫包含有时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素、时间分辨荧光微球标记的第一hba1c抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡igy抗体。
7.优选地，所述cortisol检测线、所述hba1c检测线和所述质控线分别包被有cortisol抗原-链和亲霉素、第二hba1c抗体和羊抗鸡igy抗体。
8.优选地，所述cortisol检测线、所述hba1c检测线和所述质控线的间隔为4-6mm。
9.本发明的另一方面还提供了一种糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
10.1)时间分辨标记物制备：
11.缓冲液置换：采用1mg粒径为200nm的时间分辨荧光微球加入到1ml、10-30mm的mes
缓冲液，所述mes缓冲液的ph值为5.0-6.0，在4℃、8000-15000rpm的条件下离心10-20min，弃上清液，加入400ul、10-30mm的mes缓冲液进行超声复溶，超声复溶的条件为功率200w、工作5s、间歇3s、时间1min；
12.活化：分别加入10ul、浓度为1mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和20ul、浓度为1mg/ml的n-羟基硫代琥珀酰亚胺，涡旋混匀，在35℃下转速为220rpm的恒温摇床反应20min；
13.清洗：活化结束后，在4℃、8000-15000rpm的条件下离心10-20min，弃上清液，加入400ul、10-30mm的mes缓冲液进行超声重悬，超声重悬的条件为功率200w、工作5s、间歇3s、时间1min，重复上述步骤，超声重悬备用；
14.标记抗体：分别将cortisol抗体-生物素、第一hba1c抗体和鸡igy抗体加入清洗后的溶液中，在35℃下转速为220rpm的恒温摇床反应1-3h，反应结束后在4℃、8000-15000rpm的条件下离心10-20min，弃上清液，进行超声重悬后备用；其中，cortisol抗体-生物素的加入量为50ug，第一hba1c抗体和鸡igy抗体按照与时间分辨荧光微球质量比为1:10的比例加入；
15.标记后清洗：分别加入400ul pbst清洗液，在4℃、8000-15000rpm的条件下离心10-20min，弃上清液，清洗两次，加入400ul的微球保存液进行超声重悬，分别得到时间分辨荧光标记的cortisol抗体-生物素、第一hba1c抗体以及鸡igy抗体，置于2～8℃保存备用；
16.2)喷垫：
17.将时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素、第一hba1c抗体以及鸡igy抗体按质量比3:1:1混合后，以1ul/cm，10cm/秒的速度喷涂于空白的结合垫上，干燥后即可得时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素、第一hba1c抗体以及鸡igy抗体混合物标记的结合垫；将铺好的结合垫置于鼓风干燥烘箱中干燥，37℃烘干3-5h；
18.3)划线：
19.在pvc底板上放置空白的硝酸纤维素膜，在空白的硝酸纤维素膜上按一定的间隔划cortisol检测线、hba1c检测线和质控线；然后分别取用划膜缓冲液稀释至浓度为1-2mg/ml的cortisol抗原-链和亲霉素、第二hba1c抗体和羊抗鸡igy抗体，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别划到对应的cortisol检测线、hba1c检测线和质控线上，将划线后的硝酸纤维素膜置于鼓风干燥烘箱中，37℃烘干3-5h。
20.4)试剂条的组装：
21.将制备的结合垫压在硝酸纤维素膜靠近检测线的一端，结合垫长度为8-10mm，结合垫与硝酸纤维素膜的搭接长度为1mm；然后在结合垫的一端放置样品垫，样品垫的长度为15-20mm，样品垫和结合垫的搭接长度为1-2mm；硝酸纤维素膜的另一端放置吸水纸，吸水纸长度为30-35mm，吸水纸与硝酸纤维素膜的搭接长度为1mm；干燥后即完成试剂条的组装过程。
22.优选地，所述结合垫在组装之前经处理液预先处理，所述处理液包括10-50mm hepes缓冲液、1-3％tetronic1307，所述hepes缓冲液的ph值为8.0。
23.优选地，所述cortisol抗体-生物素在标记之前预先制备，所述cortisol抗体-生物素的制备方法包括：将cortisol抗体与生物素按一定比例混匀，室温反应30min，反应结束后用20-50mm pbs进行透析反应，每隔4-8h换一次透析液，透析时长为24h；
24.所述cortisol抗原-链和亲霉素在划线之前预先制备，所述cortisol抗原-链和亲霉素的制备方法包括：将cortisol抗原与链和亲霉素按一定比例混匀，室温反应30min，反应结束后用20-50mm pbs进行透析反应，每隔4-8h换一次透析液，透析时长为24h。
25.优选地，所述划膜缓冲液的组成为0.01mol/lpbs、10g/l蔗糖，所述划膜缓冲液的ph值为7.0-7.4。
26.与现有技术相比，本发明提供了的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条，具备以下有益效果：
27.本发明提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条首创性地在一个试纸条上融合了两种检测原理，即在一个试剂条上采用双抗体夹心法和竞争法分别对待测样品中的糖化血红蛋白和皮质醇进行检测，相比于现有技术中通常将上述两个项目分开检测的情况，本发明在结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素、时间分辨荧光微球标记的第一hba1c抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡igy抗体的复合物，硝酸纤维素膜的cortisol检测线、hba1c检测线和质控线则分别包被有cortisol抗原-链和亲霉素、第二hba1c抗体和羊抗鸡igy抗体，在样品溶液层析过程中可以实现糖化血红蛋白和皮质醇在一个试纸条上联合检测，减少了检测项目和检测次数，有效地提高了检测效率，从而更好地做出诊断，提高诊断效能。
附图说明
28.图1是本发明的实施方式提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条的结构示意图。
29.图中：1、pvc底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水纸；6、cortisol检测线；7、hba1c检测线；8、质控线。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.图1是本发明的实施方式提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条的结构示意图。在本发明的一种实施方式中，如图1所示，在本发明的一种实施方式中，该糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条包括pvc底板1，pvc底板1为长条结构，pvc底板1上依次设置样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5；硝酸纤维素膜4上依次设置有cortisol检测线6、hba1c检测线7和质控线8；结合垫3包含有时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素、时间分辨荧光微球标记的第一hba1c抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡igy抗体。
32.进一步地，cortisol检测线6、hba1c检测线7和质控线8分别包被有cortisol抗原-链和亲霉素、第二hba1c抗体和羊抗鸡igy抗体。
33.本发明提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条分别采用双抗体夹心法和竞争法分别对待测样品中的糖化血红蛋白和皮质醇进行检测，使用时待测样品与样品垫2接触，通过层析作用依次层析至结合垫3和硝酸纤维素膜4。结合垫3上包被有时间分辨荧光
微球标记的cortisol抗体-生物素、时间分辨荧光微球标记的第一hba1c抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡igy抗体的复合物，硝酸纤维素膜4的cortisol检测线6、hba1c检测线7和质控线8分别包被有cortisol抗原-链和亲霉素、第二hba1c抗体和羊抗鸡igy抗体，结合垫3的两端分别与样品垫2及硝酸纤维素膜4搭接，硝酸纤维素膜4远离结合垫2的一端与吸水纸5搭接。
34.本发明提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条采用竞争法检测皮质醇：若待测样品中含有较高浓度的皮质醇，则样品中的皮质醇与结合垫3上的时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素结合，然后层析涌动至cortisol检测线6，此时cortisol检测线6中cortisol抗原-链和亲霉素无法与抗体结合；若待测样品中不含有皮质醇或者皮质醇浓度较低，则结合垫3上的时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素将与cortisol检测线6中cortisol抗原-链和亲霉素；在后续通过荧光免疫分析仪对cortisol检测线6进行检测，利用标准曲线和相应的分析软件自动计算出待测样品中皮质醇的浓度；
35.本发明提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条采用双抗体夹心法检测糖化血红蛋白：若待测样品中含有较高浓度的糖化血红蛋白，则样品中的糖化血红蛋白与结合垫3上的时间分辨荧光微球标记的第一hba1c抗体结合，然后层析涌动至hba1c检测线7，与hba1c检测线7中第二hba1c抗体结合；若待测样品中不含有糖化血红蛋白或者糖化血红蛋白浓度较低，则没有或者有较少的糖化血红蛋白与第一hba1c抗体、第二hba1c抗体结合；在后续通过荧光免疫分析仪对hba1c检测线7进行检测，利用标准曲线和相应的分析软件自动计算出待测样品中糖化血红蛋白的浓度；
36.若质控线8通过荧光免疫分析仪发现相应的信号值异常，则说明该糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条失效。
37.本发明提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条首创性地在一个试纸条上融合了两种检测原理，即在一个试剂条上采用双抗体夹心法和竞争法分别对待测样品中的糖化血红蛋白和皮质醇进行检测，相比于现有技术中将上述两个项目分开检测的情况，该糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条在样品溶液层析过程中可以实现糖化血红蛋白和皮质醇在一个试纸条上联合检测，减少了检测项目和检测次数，有效地提高了检测效率，从而更好地做出诊断，提高诊断效能。
38.在本发明的一种实施方式中，cortisol检测线、hba1c检测线和质控线的间隔为4-6mm。
39.本发明还提供了一种糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
40.1)时间分辨标记物制备：
41.缓冲液置换：采用1mg粒径为200nm的时间分辨荧光微球加入到1ml、10-30mm的mes缓冲液，所述mes缓冲液的ph值为5.0-6.0，在4℃、8000-15000rpm的条件下离心10-20min，弃上清液，加入400ul、10-30mm的mes缓冲液进行超声复溶，超声复溶的条件为功率200w、工作5s、间歇3s、时间1min；
42.活化：分别加入10ul、浓度为1mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和20ul、浓度为1mg/ml的n-羟基硫代琥珀酰亚胺，涡旋混匀，在35℃下转速为220rpm的恒温摇床反应20min；
43.清洗：活化结束后，在4℃、8000-15000rpm的条件下离心10-20min，弃上清液，加入400ul、10-30mm的mes缓冲液进行超声重悬，超声重悬的条件为功率200w、工作5s、间歇3s、时间1min，重复上述步骤，超声重悬备用；
44.标记抗体：分别将cortisol抗体-生物素、第一hba1c抗体和鸡igy抗体加入清洗后的溶液中，在35℃下转速为220rpm的恒温摇床反应1-3h，反应结束后在4℃、8000-15000rpm的条件下离心10-20min，弃上清液，进行超声重悬后备用；其中，cortisol抗体-生物素的加入量为50ug，第一hba1c抗体和鸡igy抗体按照与时间分辨荧光微球质量比为1:10的比例加入；
45.标记后清洗：分别加入400ul pbst清洗液，在4℃、8000-15000rpm的条件下离心10-20min，弃上清液，清洗两次，加入400ul的微球保存液进行超声重悬，分别得到时间分辨荧光标记的cortisol抗体-生物素、第一hba1c抗体以及鸡igy抗体，置于2～8℃保存备用；
46.2)喷垫：
47.将时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素、第一hba1c抗体以及鸡igy抗体按质量比3:1:1混合后，以1ul/cm，10cm/秒的速度喷涂于空白的结合垫3上，干燥后即可得时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素、第一hba1c抗体以及鸡igy抗体混合物标记的结合垫3；将铺好的结合垫3置于鼓风干燥烘箱中干燥，37℃烘干3-5h；
48.3)划线：
49.在pvc底板1上放置空白的硝酸纤维素膜4，在空白的硝酸纤维素膜4上按一定的间隔划cortisol检测线6、hba1c检测线7和质控线8；然后分别取用划膜缓冲液稀释至浓度为1-2mg/ml的cortisol抗原-链和亲霉素、第二hba1c抗体和羊抗鸡igy抗体，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别划到对应的cortisol检测线6、hba1c检测线7和质控线8上，将划线后的硝酸纤维素膜4置于鼓风干燥烘箱中，37℃烘干3-5h。
50.4)试剂条的组装：
51.将制备的结合垫3压在硝酸纤维素膜4靠近检测线的一端，结合垫3长度为8-10mm，结合垫3与硝酸纤维素膜4的搭接长度为1mm；然后在结合垫3的一端放置样品垫2，样品垫2的长度为15-20mm，样品垫2和结合垫3的搭接长度为1-2mm；硝酸纤维素膜4的另一端放置吸水纸5，吸水纸5长度为30-35mm，吸水纸5与硝酸纤维素膜4的搭接长度为1mm；干燥后即完成试剂条的组装过程。
52.在本发明的一种实施方式中，结合垫3在试剂条组装之前经处理液预先处理，处理液包括10-50mm hepes缓冲液、1-3％tetronic1307，hepes缓冲液的ph值为8.0。
53.需要指出的是，在本发明的实施方式中，cortisol抗体-生物素在标记之前预先制备，制备方法为：将cortisol抗体与生物素按一定比例混匀，室温反应30min，反应结束后用20-50mm pbs进行透析反应，每隔4-8h换一次透析液，透析时长为24h；
54.cortisol抗原-链和亲霉素在划线之前预先制备，制备方法为：将cortisol抗原与链和亲霉素按一定比例混匀，室温反应30min，反应结束后用20-50mm pbs进行透析反应，每隔4-8h换一次透析液，透析时长为24h。
55.进一步地，划膜缓冲液的组成为0.01mol/lpbs、10g/l蔗糖，所述划膜缓冲液的ph值为7.0-7.4。
56.本发明还提供了一种样品检测过程中需要添加的稀释裂解液的制备方法，具体如
下：
57.稀释裂解液的配制：
58.称量20-50mmol tris、0.1％-0.5％曲拉通x-100、0.1％-0.5％吐温-20、0.3％-1％十二烷基磺酸钠、0.1％-0.3％pc300；
59.稀释裂解液在样品加样的过程中加入，用于将样品裂解并稀释，从而达到检测需求。
60.糖化血红蛋白是红细胞中的红蛋白与血清中的糖类相结合的产物，在层析试剂条检测的过程中需要对全血样品进行高倍数裂解与稀释，才足以达到检测要求。而皮质醇是从肾上腺皮质中提取出的是对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素，在检测过程中，只需对待测样品进行低倍数稀释。当糖化血红蛋白和皮质醇组合联检，样品基质需要同时满足两者的要求，因此将两个项目的裂解液和稀释液融合为一，即本发明所提供的稀释裂解液，并将二者的稀释倍数进行了统一，即只要某一个固定加样倍数，即可达到原本预计的数次的裂解、稀释才能达到的预期效果，从而提高了裂解速度并能够使得样品更加均一，提高检测的准确度和精密度。
61.本发明还提供了糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条在具体检测过程中的操作方法：
62.将待测样品以及本发明提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条恢复至室温；
63.取30ul待测样品加入到稀释裂解液中，快速涡旋混匀60s，获得混合样品；
64.吸取上述混合样品80ul，通过加样孔滴加到本发明提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条的样品垫2上，反应10min；
65.开启荧光免疫分析仪，初始化自检完毕后，并进行检测。可通过标准曲线和相应的分析软件自动分别计算出待测样品的浓度。
66.本发明的实施方式提供的糖化血红蛋白与皮质醇联合检测试剂条首创性地在一个试纸条上融合了两种检测原理，即在一个试剂条上采用双抗体夹心法和竞争法分别对待测样品中的糖化血红蛋白和皮质醇进行检测；使用时待测样品与样品垫2接触，通过层析作用依次层析至结合垫3和硝酸纤维素膜4；结合垫3上包被有时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素、时间分辨荧光微球标记的第一hba1c抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡igy抗体的复合物，硝酸纤维素膜4的cortisol检测线6、hba1c检测线7和质控线8分别包被有cortisol抗原-链和亲霉素、第二hba1c抗体和羊抗鸡igy抗体，结合垫3的两端分别与样品垫2及硝酸纤维素膜4搭接，硝酸纤维素膜4远离结合垫2的一端与吸水纸5搭接；待测样品中的皮质醇与结合垫3上的时间分辨荧光微球标记的cortisol抗体-生物素结合，使得cortisol检测线6中的cortisol抗原-链和亲霉素无法与抗体结合；糖化血红蛋白在层析过程中先与结合垫3上的时间分辨荧光微球标记的第一hba1c抗体分别结合，然后再与hba1c检测线7上的第二hba1c抗体结合，从而实现糖化血红蛋白和皮质醇在一个试剂条上联合检测，可以减少检测项目和检测次数，有效地提高了检测效率。
67.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。