一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法。


背景技术：

2.三磷酸化合物作为一种高能代谢产物，主要代表有三磷酸腺苷(atp)，其合成主要通过多种细胞途径产生，最典型的如在线粒体中通过氧化磷酸化由atp合成酶合成。atp合成的主要能源为葡萄糖和脂肪酸，人体中每天的能量需要水解200-300摩尔的atp，且atp不能被存储，合成的atp短时间内会被消耗掉。
3.体内或细胞内的atp检测一般采用电泳法、光学分析法、层析法三种方法，其中层析法包含纸电泳法、凝胶电泳法、毛细管电泳法，光学分析法包含分光光度法、生物发光法，层析法包含纸层析、薄层层析法、离子交换色谱法、高效液相色谱法，检测原理一般为发光基团。
4.三磷酸类的药物目前主要是针对于抗病毒的领域。三磷酸类化合物作为药物治疗的有效成分一般是通过药物经过体内的代谢形成，比较成功的药物有吉西他滨和索非布韦，药物进入体内后首先代谢形成单磷酸代谢物，然后在磷酸化酶的作用下形成二磷酸的中间状态，随后形成三磷酸的高能代谢物形态。其中，索非布韦吸收后在肝脏内先代谢成三磷酸尿嘧啶类似物(尿苷三磷酸类似物)，三磷酸尿嘧啶类似物可以掺入到hcv rna链中，并“假扮”成病毒复制时需要的核苷三磷酸“掺合”到新生病毒rna链中，与丙肝病毒复制所需的ns5b聚合酶发生竞争性结合，用假“核苷”代替了病毒复制所需的真“核苷”以形成错误的病毒rna模板，从而导致病毒rna链的延长提前中止，丙肝病毒复制也因此被终止。
5.由于三磷酸化合物合成成本高，合成周期长，对于半定量和定量质谱检测研究来说，测定生物样本中三磷酸代谢物的浓度时，需要获得一定数量和纯度的三磷酸标准品来进行液相质谱条件的优化和质谱条件的摸索；三磷酸化合物在合成过程中具有需要高温强酸、反应周期长、反应条件对环境不友好等不利因素，特别在前期候选化合物筛选过程中会很大程度的降低研发效率，增加研发成本，不利于快速筛选出有潜力的候选化合物。
6.其中，采用常规的液相方法用于测定生物样本中三磷酸代谢物的浓度时，由于三磷酸类化合物的结构特点，在常规的反相色谱柱中具有无保留、色谱峰拖尾、残留大的特点，同时很多液相条件与质谱体系不兼容，比如离子对试剂：三乙胺和六氟异丙醇试剂，此类试剂会抑制化合物的信号影响质谱的适用寿命等比例因素。
7.而采用常规的质谱方法测定生物样本中三磷酸代谢物的浓度时，常规质谱条件的摸索需要配制三磷酸化合物的标准品，配置成储备液进行质量数和二级碎片离子的寻找，结合三磷酸化合物的合成成本高，对于筛选阶段的质谱方法，常规的生物分析方法开发途径对合成部门的依赖较大。
8.基于上述分析，若目标检测物为生物基质中的三磷酸化合物，生物基质中存在很多其他的三磷酸内源物质可能对目标检测物的检测存在干扰，造成检测结果不准确；对于
液相方法，一般选用阴离子交换色谱和离子对试剂进行三磷酸化合物进行色谱分离，质谱检测需要考虑到液相流入质谱的成分是否对质谱的稳定性和寿命造成影响。因此，传统的用于测定生物样本中三磷酸代谢物浓度的分析方法具有如下不足：
9.1、干扰较大：传统的检测手段，比如电泳法和液相色谱法，目标检测物和其他三磷酸内源物质很难达到基线分离，同时定量的标准曲线和质控样本一般选用单一的化合物进行配制，和真实基质存在很大的差别，无法准确评估真实样本中干扰对定量带来的影响；
10.2、液相不稳定：对于三磷酸的检测一般选用阴离子交换会离子对试剂进行化合物的色谱保留和成峰，但是这些液相分离的方法对流动相的成分要求很高，比如阴离子交换色谱，需要很准确的保证流动相的酸碱度的稳定性和稳定的有机相比例；对于离子对试剂来说，试剂的级别、供应商和杂质成分都会对化合物的保留时间和信号造成极大的影响，导致方法的稳定性和重现性变差；
11.3、质谱不友好：对于三磷酸化合物的质谱条件开发，目前还是要依托前端的液相分离，液相条件的成分将很大程度上决定是否可以进行质谱检测，常规的阴离子交换色谱和离子对试剂因流动相中含有无法挥发的成分，会粘在质谱质量轴上影响信号和稳定性，此两种流动相均无法进入质谱进行质荷比的检测。


技术实现要素：

12.为解决上述技术问题，本发明提供了一种三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法，包括如下步骤：
13.s1.样品处理；
14.s2.采用液相色谱-质谱联用仪对样品进行检测；
15.其中，步骤s2中液相色谱条件为：采用阴离子交换色谱柱；流动相a为酸性流动相，有机相成分为20％～50％乙腈(acn)，同时含有1～10mm的缓冲盐，酸碱度通过加入甲酸进行调节，控制在4～6；流动相b为碱性流动相，有机相成分为20％～50％乙腈(acn)，同时含有1～10mm的缓冲盐，酸碱度通过加入甲酸进行调节，控制在9～10；进样器温度为4℃；进样量为2.0μl；流速为0.4ml/min；基于流动相a和流动相b的梯度洗脱程序为0～0.50、10～30％b，0.50～2.50、95％b，2.50～3.50、95％b，3.50～3.51、10～30％b，3.51～5.00系统控制；
16.其中，步骤s2中质谱条件为：扫描方式为选择离子监测(mrm)，离子化模式为负离子模式，离子源为电喷雾离子源(esi)，碰撞气压力中等，帘气压力为25psi，雾化气压力为40psi，辅助气压力为50psi，喷雾电压为-4500v，雾化气温度为550℃。
17.其中，步骤s1中，样品湿冰环境温度下融化后，涡旋混匀；取定量样品至96孔板中；向96孔板中分别加入定量内标工作溶液，加入定量acn，混合均匀，加入定量水混匀；将96孔板放入离心机进行离心；转移定量上清溶液至96孔板后，吹干，用定量水复溶；震荡，然后将溶液转移到进样板中进样。
18.其中，步骤s2中，流动相a配制时，按体积比取定量h2o至玻璃瓶中，加入定量挥发性缓冲盐溶液，混匀，用可挥发性酸调节ph至4.0-6.0，然后定量加入乙腈(acn)，混匀后超声15分钟。
19.其中，步骤s2中，流动相a配制时，所述挥发性缓冲盐为醋酸铵或甲酸铵，可挥发性
酸为甲酸或乙酸。
20.其中，步骤s2中，流动相b配制时，按体积比例取定量h2o至玻璃瓶中，加入定量挥发性缓冲盐溶液，混匀，用可挥发性碱调节ph至9.0-11.0，然后定量加入乙腈(acn)，混匀后超声15分钟。
21.其中，步骤s2中，流动相b配制时，所述挥发性缓冲盐为醋酸铵或甲酸铵，可挥发性碱为氨水。
22.其中，步骤s2中，洗针液r0和r3配制时，按体积比例取定量乙腈(acn)和定量h2o至玻璃瓶中，加入定量的氨水，混匀。
23.其中，步骤s2中，质谱检测时，待测物的q1为[m-1]，其中q1为母离子的质量数，m为待测物的单一同位素分子量；三磷酸化合物的子离子为二磷酸片段，质荷比为159.0；检测的离子对为[m-1]/159.0。
[0024]
通过上述技术方案，本发明的目的开发一种简单便捷的液相串联质谱的方法以满足三磷酸化合物的半定量和定量的生物样本分析检测；液相系统部分的流动相使用易挥发成分的缓冲盐体系并对流动相的酸碱度进行控制，以满足大部分三磷酸的检测工作，从而通过引入友好型的溶剂成分解决传统流动相无法直接进入质谱的问题，解决了三磷酸传统方法干扰大的问题，有效的提高了三磷酸化合物液相方法的稳定性，同时此液相方法与质谱兼容，并通过计算机辅助有效解决了液相质谱方法对三磷酸化合物标准品的依赖。
具体实施方式
[0025]
本实施例以代表性化合物索非布韦三磷酸代谢物对本发明提供的三磷酸类化合物浓度液相质谱联用检测方法进行描述。
[0026]
1、实验目的：
[0027]
建立索菲布韦三磷酸代谢物的lc-ms/ms分析方法，用于测定s-d大鼠肝组织、pbmc以及细胞中索菲布韦三磷酸代谢物的浓度。
[0028]
2、实验材料：
[0029]
2.1实验仪器
[0030][0031]
[0032]
2.2实验试剂
[0033][0034]
2.3溶剂信息
[0035][0036][0037][0038]
[0039][0040]
注：在必要时可以按比例改变溶液配制体积，实际配制体积将会在实验记录中录入。
[0041]
3液相质谱条件：
[0042]
3.1液相条件
[0043][0044][0045]
3.2质谱条件
[0046][0047]
4、样本的处理过程：
[0048][0049][0050]
5、定量方法：
[0051][0052]
6、基于1-5的条件，具体实施方式描述如下：
[0053]
6.1流动相a的配制：精移取693ml h2o至1000ml的玻璃瓶中，加入适量的1m缓冲液溶液，混匀，用酸调节ph至4.0-6.0，精密加入300ml acn，混匀后超声15分钟；其中，1m缓冲盐使用醋酸铵、甲酸铵等挥发性的成分进行配制；缓冲液的体积用量为0.5-8ml的体积范
围；用于调节酸碱度的酸使用可挥发性的甲酸、乙酸等进行配制，以减少对质谱系统的影响；
[0054]
6.2流动相b的配制：精移取700ml h2o至1000ml的玻璃瓶中，加入适量的1m缓冲盐溶液，混匀，用碱调节ph至9-11，精密加入300ml acn，混匀后超声15分钟；其中，1m缓冲盐使用醋酸铵，甲酸铵等挥发性的成分进行配制；缓冲液的体积用量为0.5-8ml的体积范围；用于调节酸碱度的可挥发性酸使用甲酸、乙酸等进行配制，以减少对质谱系统的影响；
[0055]
6.3化合物的洗脱主要是通过碱使其变成离子状态，洗针液r0和r3的配制：精密移取300ml acn和700ml h2o至1000ml的玻璃瓶中，加入1.0ml的碱，混匀；碱一般为氨水或其他弱碱；
[0056]
6.4洗脱条件：梯度洗脱时，液相保留主要是让化合物在高比例的流动相a存在的条件下在色谱柱上结合，然后通过流动相b进行洗脱；其中，流动相a是通过6.1的方式进行配制，流动相b是通过6.2的方式进行配制；
[0057]
6.5质谱检测：质谱条件的确定是先确认负离子模式下母离子的分子离子峰[m-1]，和其二级碎片159.0；其中，m是单一同位素分子量是通过计算机算出其分子量；二级碎片是此类化合物的特征碎片，来源于化合物的二磷酸碎片；
[0058]
6.6计算机辅助计算化合物的质谱参数：
[0059][0060]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。