一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法

本发明属于环境新污染物筛查，具体涉及一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法。

背景技术：

1、pm2.5是空气动力学直径小于2.5微米的大气悬浮颗粒物,是由悬浮在空气中多种来源的固体和液体颗粒组成的不均匀混合物,其化学组成会随时间和空间的变化而变化。许多与颗粒物结合的化合物被发现具有遗传毒性、致突变性和致癌性。大量流行病学和实验证据表明，pm2.5污染与多种健康风险有关，如呼吸系统疾病，心血管疾病，肺癌和神经系统损伤等。不同组分的颗粒物具有不同的毒性效应及作用机制。其中有机组分是影响pm2.5毒性效应的重要因素之一。虽然毒理学研究表明不同组分在pm的细胞毒性、氧化应激、活性氧（ros）生成、dna 损伤和促炎作用中的贡献不同，但是目前仍然无法有效地探讨不同成分对颗粒物整体毒性的贡献，缺乏对颗粒物毒性作用机理的完整理解。此外，由于颗粒物中有机组分种类丰富，约占颗粒物的19%-60%，但其中仅有5%-10%被鉴定出来，因此导致靶向分析识别pm2.5中有机组分陷入瓶颈，且目前大部分研究集中在多环芳香烃化合物和其衍生物、多氯联苯醚等。因此需要全面识别与鉴定颗粒物中的有机组分并对其健康效应进行分析。高通量、高分辨和较好灵敏度的gc-hr-tof-ms的非靶向筛查技术具有大范围筛选微量物质，并对未知化合物定性识别的优点，因此可作为识别颗粒物有机组分的重要工具。

2、由于颗粒物负载的有机物种类繁多，成分复杂，因此全面分析其上全部有机物质及其健康效应是不现实的。

技术实现思路

1、本发明为了解决由于pm2.5负载的有机物种类繁多，成分复杂，导致化学分析中检测的盲目性和生物测试中效应物质的不确定性等问题，提供了一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法。利用高分辨、高灵敏度的气相色谱-高分辨飞行时间质谱gc-hr-tof-ms对其有机组分进行全面的非靶向识别，同时结合效应导向分析方法分离、鉴定大气细颗粒物中的关键毒性物质。

2、本发明由如下技术方案实现的：一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法，利用高分辨、高灵敏度的气相色谱-高分辨飞行时间质谱gc-hr-tof-ms、综合ei/ecni两种电离模式，对大气细颗粒物的有机组分进行全面的非靶向识别，利用了效应导向分析eda，以关键毒性作为导向，筛选鉴定大气细颗粒物中的关键毒性物质。

3、具体方法为：

4、（1）大气细颗粒物总有机组分提取：使用大流量大气颗粒物采样器采集颗粒物样品，建立基于加速溶剂萃取仪ase的pm2.5有机组分非靶向全提取方法，针对大气细颗粒物负载的有机组分进行提取；

5、具体分为：极性组分提取：萃取剂甲醇，萃取温度100℃，加热时间5 min，平衡萃取时间10 min，循环次数2，润洗体积30%，灌注时间60s；

6、非极性组分提取：萃取剂为体积比1：1的正己烷/丙酮混合溶液，萃取温度100℃，加热时间5 min，平衡萃取时间10 min，循环次数2，润洗体积30%，灌注时间60s；

7、分别合并2次萃取液，旋转蒸发、氮吹浓缩至恒重，差值法称量提取物总重量；

8、（2）大气细颗粒物有机组分分离：a、将步骤（1）提取得到的大气细颗粒物总有机组分采用反向液相色谱rp-hplc进行色谱分馏；利用pahs混标和磺胺类抗生素混标标定色谱收集时间；具体液相方法为：仪器：qbh-lc；色谱柱：sunniest c18, 4.6 mm × 5 μm× 250mm；紫外检测器波长：220 nm&290 nm；流动相：a-纯水，b-乙腈，1.0 ml/min；梯度：0min，50%b；2.5 min，50% b；5.5 min，100% b；11.5 min，100% b；14.5 min，50% b；17 min，50%b；馏分收集器采用时间窗口模式，间断性收集得到一级样品；

9、筛选：将分馏得到的一级有机组分分别对毒理学对应的体外细胞模型进行染毒，以细胞对应的非特异性指标作为毒理学终点，结合qrt-pcr技术检测一级有机组分对细胞上皮间质转化emt过程标志因子（如e-cad、n-cad、fib、vim）表达的影响，初步筛选得到细颗粒物上毒性组分，并进行二级分馏；

10、b、将需要二级分馏的样品，溶剂替换为体积比为1：1的丙酮/乙酸乙酯混合溶液，进行正相液相色谱np-hplc法色谱分馏；同样利用pahs混标和磺胺类抗生素混标标定色谱收集时间；具体液相方法为：仪器：qbh-lc；色谱柱：intersil sil-100a , 4.6 mm × 5 μm× 250 mm；紫外检测器波长：254 nm；流动相：a-正己烷，1.0 ml/min；等度洗脱：100% a，15min；馏分收集器采用时间窗口模式，间断性收集得到二级样品；

11、将分馏得到的二级有机组分分别对毒理学对应的体外细胞模型进行染毒，以细胞的对应的非特异性指标作为毒理学终点，从而筛选得到细颗粒物上关键毒性组分；

12、（3）大气细颗粒物关键毒性组分的鉴定：利用气相色谱结合高通量和高分辨率质谱的气相色谱-高分辨飞行时间质谱gc-hr-tof-ms仪器，使用ei/ecni两种电离模式对步骤（2）筛选得到的关键毒性组分进行物质全扫描，得到包含色谱质谱信息的所有组分的总离子流图，然后根据高分辨率的质谱碎片信息和色谱保留时间结合nist等质谱数据库，对总离子流图中的各色谱质谱信息定性，从而识别筛选到的关键物质。

13、步骤（2）中所述细胞对应的非特异性指标为细胞迁移能力、存活率或炎性指标。

14、步骤(2)中所述毒理学对应的体外细胞模型为人肺癌a549细胞，细胞对应的非特异性指标为细胞迁移能力。

15、本发明提供了一种大气细颗粒物有机组分中的效应组分的非靶向筛选和鉴定方法，适用于研究大气细颗粒物中效应组分的筛查，比如促癌组分、心血管毒性、神经毒性等。本发明不仅可以全面的识别大气细颗粒物负载的有机物质，还能利用效应导向方法筛选出引起特定疾病的关键效应组分。与传统的毒理学实验相比，本研究结合了化学分析，将生物效应与效应污染物联系起来，克服了单一化学分析或单一生物测试在环境样品应用中的不足，不仅可以测试样品的生物效应，且能明确效应物，避免了化学分析中检测的盲目性和生物测试中效应物质的不确定性，为探究复杂大气pm2.5中不同有机组分的潜在毒性风险和致病机制提供了方法。

16、为了筛选、识别颗粒物引起某一特定疾病的关键有机组分，我们利用了效应导向分析（effrct-directed analysis，eda）的原理，eda的基本原理如图1所示。效应导向分析是一套针对复杂有机污染物的分析测试方法，它综合运用生物测试与化学分析，以生物效应为导向，指导活性组分的分离，并对组分进行定性，实现效应物的鉴定，最终明确样品的生物效应和主要效应物。

17、本发明所述方法结合了毒理学实验和化学分析，将生物效应与效应污染物联系起来，克服了单一化学或单一生物测试在环境样品应用中的不足，不仅可测试样品的生物效应，且能明确效应化合物，避免了化学分析中检测的盲目性和生物测试中效应物质的不确定性，为探究复杂大气pm2.5中不同有机组分的潜在毒性风险和致病机制提供了方法。本发明利用效应导向分析方法，结合gc-hr-tof-ms，以肺癌为特异的疾病终点，分离、鉴定颗粒物关键促癌效应组分，以实现对颗粒物关键促癌效应组分的针对性控制。