一种基于ZrMOFs@PEI@AuAgNCs复合物的双波长ECL传感器及其应用

：本发明涉及一种基于zr mofs@pei@auag ncs双波长发光的ecl传感器；以及所述传感器的制备及其检测mirna-141及mirna-155的分析应用。

背景技术

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背景技术：

1、microrna(mirna)，作为一种基于内源性基因编码的单链rna结构，涉及到了人体内免疫反应的方方面面，精准地检测痕量的mirna对人类的健康生活至关重要[martins,c.s.m.et.al,acs sensors,2022,7,1269-1299.]。电化学发光(ecl)技术灵敏度和准确性高，是现代分析化学中检测痕量物质的一种可信的检测方法。近年来，在使用有机分子作为配体来合成具有ecl发光性质的金属有机骨架mofs的过程中，不可避免地会发生聚集诱导猝灭(acq)现象[huang,y.,wang,z.,et,al.angew.chem.,int.ed.engl.2019,58,9696-9711.]。有研究发现以zr离子作为中心节点，选取有聚集诱导发光(aie)效应的1,1,2,2-tetra(4-carboxylbiphenyl)ethylene(h4tcbpe)分子作为连结配体，制备具有聚集诱导电化学发光(ai-ecl)效应的金属有机骨架zr-tcbpe-mof(zr mofs)，可以提高整体的发光量子产率[wei,z.w.,gu,z.y.,et,al.j.am.chem.soc.2014,136,8269.]。同时为了解决有机体导电性差、电子转移效率低的问题，我们选取具有大量叔胺基团的聚亚乙烯亚胺(pei)分子作为共反应物锚定于zr mofs表面，实现二者之间超近距离的电子交换。同时，将具有优良电催化活性与电导率的auag ncs负载于zr mofs@pei表面，以加速复合物中电子的转移速率，解决载体zr mofs在电子流动方面相对劣势的难题，zr mofs又能增强auag ncs ecl信号的稳定性。

2、本文基于zr mofs@pei@auag ncs纳米复合材料与猝灭基团bhq之间的共振能量转移效应，结合高效的dna walker循环剪切与高度稳定的三维dna四面体tdn结构，构建了一种双波长生物传感器可以实现对mirna-141与mirna-155准确检测。通过灵活多变的碱基配对策略，该传感器可成为各种基因序列的通用检测平台，在未来的临床分析、疾病检测等领域将具有无可比拟的应用价值。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的之一是合成zr mofs@pei@auag ncs纳米复合材料用于构建生物传感器。

2、具体包括以下步骤：

3、步骤1.六边形片状zr-tcbpe-mof的合成：首先，取30mg的h4tcbpe与60mg的zrcl4溶解于3.6ml的dmf中，再加入0.4ml的ch3cooh并在超声作用下混合均匀。然后，将上述混合溶液加至聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热反应釜中并在120℃下加热24h，待反应结束并冷却后用二次水和无水乙醇依次洗涤产物三次。最后，将通过离心收集的亮黄色产物置于60℃的烘箱中干燥并保存备用。

4、步骤2.金银双金属纳米团簇auag ncs的合成：将13.1ml的二次水、1.5ml haucl4(20mm)与0.3ml agno3(20mm)依次加入50ml规格的三口烧瓶中。之后，将0.45ml的谷胱甘肽(100mm)溶液加至上述混合溶液中，并于室温下搅拌10min，待其混合均匀后，将其置于70℃的水浴锅中加热回流24h。合成的auag ncs经超滤离心管(mwco 3k)离心纯化15min后，置于4℃的环境中避光保存。

5、步骤3.zr mofs@pei@auag ncs纳米复合材料的合成：第一步，取20mg之前制备的zr mofs超声溶解于5ml二次水中，再向其中加入2ml edc(100mm)与2ml nhs(25mm)溶液并在37℃下活化40min。再将其与5ml的pei(1％)溶液超声混合，并继续孵育6h，离心纯化并将产物重新分散于5ml二次水中，制备zr mofs@pei复合物。第二步，取500μl之前经超滤离心纯化后的auag ncs于等体积的二次水中稀释，再向其中分别加入50μl与之前相同浓度的edc与nhs溶液进行活化，最后，取1ml之前合成的zr mofs@pei复合物与其混合，并在之前相同的条件下混合孵育，随后经纯化并重分散于1ml的二次水中，得最终产物zr mofs@pei@auag ncs纳米复合材料。

6、本发明的目的之二是合成三维dna四面体(tdn)来构建多功能的淬灭探针和walker放大器。

7、具体包括下步骤：

8、三维dna四面体(tdn)的制备：将以te缓冲液(10mm tris-hcl，1mm edta，ph 8.0)为溶剂的50μl的n4(n5，w1或w2)捕获探针(10μm)与同体积同浓度的氨基修饰的dna链(n1，n2和n3)混合，将混合溶液放置于95℃的水浴锅中加热5min后，再快速转移至4℃的环境中冷却，获得四种稳定的不同tdn结构。上述dna的序列如下：

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11、本发明的目的之三是首次构建以zr mofs@pei@auag ncs纳米复合材料为基础的双波长生物传感器用于检测多种mirnas。

12、具体包括下步骤：

13、步骤1.生物传感器的构建：首先，将自制的ito电极依次放置于丙酮、1m naoh(乙醇与二次水体积比为1：1的混合溶液)和二次水中超声15min，从而使电极表面修饰上羟基基团，待其干燥后，用密封膜包缠ito电极以获得面积为0.25cm2(0.5cm×0.5cm)的方形区域。

14、将10μl 10μm的带有猝灭团bhq1的s1链和bhq3的s2链分别与之前合成的40μltdn1和tdn2杂交2h，以获得tdn1+s1-bhq1与tdn2+s2-bhq3两种杂交体。同理，将10μl 10μm的blocker1链和blocker2链分别与之前合成的40μl tdn3-walker1和tdn4-walker2杂交2h，以获得tdn3-walker1+blocker1与tdn4-walker2+blocker2两种杂交体。上述dna的序列如下：

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16、接下来，取20μl之前制备的zr mofs@pei@auagncs溶液均匀铺展在ito电极的方形区域，待其成膜稳定后，用20μl edc(100mm)与nhs(25mm)的混合溶液(体积比1：1)对薄膜表面进行活化，接着将20μl四种tdn杂交体等比例混合溶液滴涂于活化后薄膜上进行酰胺结合，最后使用1mm的巯基乙醇(mch)封板2h以完成生物传感器的构建，需注意，每一步修饰完成之后都需使用二次水对电极表面进行小心清洗。

17、步骤2.检测目标mirnas：该工作中，在对目标mirna-141和155进行分析时，将20μl不同浓度的目标mirnas与5u的t7 exo混合，并置于生物传感器表面孵育2h，随之通过检测传感器的信号值即可确定目标分析物的浓度。

18、步骤3.ecl检测：ecl测定用mpi-e ecl分析仪在pbs(0.1m,ph 7.4)中加入0.05m三乙胺tea进行检测。扫描速度为100mv/s，扫描范围为0v～1.5v,zr mofs的光电倍增管电压为800v,auag ncs的光电倍增管电压为900v。通过特殊的光学滤波器得到两个波长的ecl信号，该滤波器只能发出ecl对应波长的光，从而区分535nm和644nm处的ecl信号值。

19、上述dna的序列如下：

20、mirna-141 uaa cac ugu cug gua aag aug g

21、mirna-155 uua aug cua auc gug aua ggg gu