基于代谢组学的食管鳞癌淋巴结转移诊断标志物及其应用

1.本发明属于临床检验诊断领域，具体涉及基于代谢组学的食管鳞癌淋巴结转移诊断标志物及其应用。


背景技术：

2.早期的食管癌临床症状不明显，难于发现，大多数食管癌患者在确诊时已为局部晚期或存在远处转移。最近的资料表明，淋巴结转移是影响食管癌患者临床预后的关键因素。非转移性食管癌患者术后5年总生存率为70-92％，而转移性食管癌患者术后 5年总生存率仅为18-47％。虽然通过手术和辅助放化疗取得了显著的进展，但食管癌患者总体预后仍然较差，这可能是由于早期症状较少和目前缺乏早期的灵敏诊断方法所致。因此，通过更灵敏的检测手段，根据淋巴结转移情况对早期食管癌患者进行诊断，以支持临床医生调整治疗方案，改善我国食管癌患者预后至关重要。
3.代谢组学是对生物样品(如血浆、血清、尿液、粪便、唾液等)或细胞内所有小分子代谢物(如氨基酸、脂肪酸、脂质等)进行定性定量分析，并寻找代谢物与病理生理变化的相对关系的一门科学。由于生物体内的信息传递是按照dna、mrna、蛋白质、代谢物的方向逐级传递的，所以可以将代谢组学看作基因组学和蛋白质组学的最终产物和表型。基因组学和蛋白质组学虽然可以揭示生物体的内在差异，但由于生物体的代偿机制，这些差异并不一定会导致表型差异。而小分子代谢物既可反映生物体的内在差异，又可能体现出外来因素对生物体的干扰与影响。目前食管癌的发病机制尚未完全清楚，但与饮食、吸烟、饮酒等因素有关。因此，使用代谢组学技术寻找食管癌淋巴结转移时的代谢物变化特征是符合其发病规律的。
4.目前已有研究者利用血浆代谢组学技术对食管癌淋巴结转移情况进行了研究，例如jin h等(jin h,qiao f,chen l,lu c,xu l,gao x.serum metabolomic signaturesof lymph node metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.j proteome res. 2014sep 5；13(9):4091-103)、zhang h等(zhang h,wang l,hou z,ma h,mamtiminb,hasim a,sheyhidin i.metabolomic profiling reveals potential biomarkersin esophageal cancer progression using liquid chromatography-massspectrometry platform.biochem biophys res commun.2017sep 9；491(1):119-125.) 分别使用气相色谱质谱联用技术(gc-ms)、液相色谱质谱联用技术(lc-ms)技术分析血浆样本，通过传统统计学方法如逻辑回归分析、主成分分析法(pca)对所获数据进行分析，以寻找食管癌转移相关生物标志物。
5.但这些研究大多仅选择小量样本，使用普适性色谱方法，筛选得到一系列小分子代谢产物作为标志物，并且没有报告所筛选代谢物诊断食管癌淋巴结转移的灵敏度和特异性，实际临床意义十分有限。因此，采用大规模临床样本进行血浆代谢组学研究，寻找灵敏度高、特异性好且安全经济的食管癌淋巴结转移诊断血浆代谢标志物具有重要的临床应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、 1-methylnicotinamide、nicotinamide的用途。
7.一方面，本发明提供了1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、 1-methylnicotinamide、nicotinamide作为开发检测或辅助检测或筛查或辅助筛查食管鳞癌淋巴结转移的标志物中的应用。
8.上述1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、 nicotinamide为来自血浆的代谢物。
9.另一方面，本发明提供了检测1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、 1-methylnicotinamide、nicotinamide的物质在如下至少一种中的应用：
10.1)检测或辅助检测食管鳞癌淋巴结转移；
11.2)筛查或辅助筛查食管鳞癌淋巴结转移。
12.上述检测1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、 nicotinamide的物质为检测血浆代谢物中1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、 1-methylnicotinamide、nicotinamide的浓度。
13.上述物质包括超高效液相色谱质谱联用所需仪器和/或试剂，还包括记载所述超高效液相色谱质谱联用条件的可读载体；
14.上文中，上述物质还包括血浆代谢物提取所需仪器和/或试剂。
15.还有一方面，本发明提供了用于检测血浆代谢物中 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、nicotinamide浓度的超高效液相色谱-质谱联用仪器和/或试剂和记载所述超高效液相色谱-质谱联用仪器使用参数的可读载体在制备具有如下至少一种功能产品中的应用:
16.1)检测或辅助检测食管鳞癌淋巴结转移；
17.2)筛查或辅助筛查食管鳞癌淋巴结转移。
18.上述筛查的对象为食管鳞癌患者。
19.上文中，所述可读载体中的记载的超高效液相色谱质谱联用仪器使用参数如下：
20.1)流动相条件：本项目使用acquity uplc-i/class-tq-s(waters)超高效液相色谱串联质谱仪，通过waters acquity uplc hss t3(100
×
2.1mm,1.8μm,waters) 液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱a相为含有10mm甲酸铵和0.02％(体积百分含量)甲酸的溶液(溶剂为水，溶质为甲酸铵和甲酸)，b相为甲醇。柱温箱温度为40℃，样品盘设为10℃，进样体积为10μl。
21.2)质谱条件：
22.本项目使用waters xevo tq-s三重四极杆质谱仪，以多反应监测(mrm)模式进行质谱分析。离子源参数如下：capillary voltages＝2.5kv,cone voltages＝30v, desolvation temperature＝550℃,desolvation gas flow＝1100(l/hr),cone gasflow＝150(l/hr),nebuliser gas flow＝7.0(bar)。
23.还有一方面，本发明提供了一种筛查或辅助筛查食管鳞癌淋巴结转移的试剂盒，包括如下组分：上文中用于检测血浆代谢物中1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、 1-methylnicotinamide、nicotinamide的浓度的物质，和记载有模型的载体或者负载有模型
的装置；
24.所述模型由输入信息(1)和输入信息(2)建立并且用于展示所述输入信息(1) 和所述输入信息(2)之间的关系；所述输入信息(1)为：建模组所有受试者的血浆代谢物中1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、 nicotinamide的浓度的信息；(2)建模组所有受试者的表型，即为食管鳞癌患者发生淋巴结转移或食管鳞癌患者未发生淋巴结转移；所述建模组由n例食管鳞癌淋巴结转移患者与m例食管鳞癌非淋巴结转移患者组成，n为自然数(在本发明的实施例中n 为26)，m为自然数(在本发明的实施例中m为53)。
25.还有一方面，本发明一种用于筛查或辅助筛查食管鳞癌淋巴结转移的装置，包括检测装置和结果输出装置；
26.检测装置用于检测待测者血浆代谢物中1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、nicotinamide的浓度；
27.所述结果输出装置用于接收检测装置输出的待测者血浆代谢物中 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、nicotinamide的浓度，并且将所述信息输入模型，由模型输出结果，预测待测者是否发生食管鳞癌淋巴结转移；
28.所述模型由输入信息(1)和输入信息(2)建立并且用于展示所述输入信息(1) 和所述输入信息(2)之间的关系；所述输入信息(1)为：建模组所有受试者的血浆代谢物中1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、 nicotinamide的浓度的信息；(2)建模组所有受试者的表型，即为食管鳞癌淋巴结转移患者或食管鳞癌非淋巴结转移患者；所述建模组由n例食管鳞癌淋巴结转移患者与 m例食管鳞癌非淋巴结转移患者组成，n为自然数，m为自然数。
29.还有一方面，本发明一种筛查或辅助筛查食管鳞癌淋巴结转移的装置，包括模型负载装置、检测装置和结果输出装置；
30.所述模型负载装置即负载模型的装置；所述模型由输入信息(1)和输入信息(2) 建立并且用于展示所述输入信息(1)和所述输入信息(2)之间的关系；所述输入信息(1)为：建模组所有受试者的血浆代谢物中1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、 1-methylnicotinamide、nicotinamide的浓度的信息；(2)建模组所有受试者的表型，即为食管鳞癌淋巴结转移患者或食管鳞癌非淋巴结转移患者；所述建模组由n例食管鳞癌淋巴结转移患者与m例食管鳞癌非淋巴结转移患者组成，n为自然数，m为自然数；；
31.检测装置用于检测待测者血浆代谢物中1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、 1-methylnicotinamide、nicotinamide的浓度；
32.所述结果输出装置用于接收检测装置输出的待测者血浆代谢物中 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、nicotinamide的浓度的信息，并且将所述信息输入模型负载装置，预测待测者是否发生食管鳞癌淋巴结转移。
33.上文中，由输入信息(1)和输入信息(2)建立并且用于展示所述输入信息(1) 和所述输入信息(2)之间的关系在本发明的实施例中，是根据随机森林算法进行，随机森林算法的参数如下：所使用的r语言软件为4.2.0版本，randomforest算法来自 r语言randomforest包4.7-1.1版本，随机种子设置为008，并使用r语言proc包 (1.18.0版本)评估模型的性能。
34.针对目前食管癌淋巴结转移常见，但缺少有效的液体诊断方法这一现状，本发明提供了一种适合于诊断食管癌淋巴结转移的生物标志物。该标志物对于诊断食管癌是否发生淋巴结转移具有较好的灵敏性和特异性，可用于食管癌分期诊断和手术决策，对于改善食管癌预后，提高患者的生存率具有重要意义。
35.本发明对130例食管癌患者的血浆样本进行分析，其中包括43例淋巴结转移患者和 87例淋巴结未转移患者样本。使用uhplc-mrm-ms/ms的方法，采用内标定量法，针对样品中的3个目标化合物：1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide, 1-methylnicotinamide，nicotinamide进行血浆代谢物浓度测定，采用随机森林算法，以3个代谢物的血浆代谢物浓度为特征，得到可以诊断食管癌淋巴结转移的模型，利用待测样本的3个目标化合物浓度可以快速的诊断出食管癌患者是否发生淋巴结转移，具有高准确性、高灵敏度、普适性强的优势，可为临床诊疗提供有力的科学依据。
附图说明
36.图1为食管鳞癌淋巴结转移的单细胞代谢图谱(1a)和食管鳞癌组织非靶向代谢组的代谢通路分析结果(1b)。
37.图2为靶向代谢组学提取离子色谱图示例；2a为标准品溶液提取离子色谱图，2b 为样品提取离子色谱图，图中各色谱峰依次见图中示例标注。
38.图3为3个代谢物烟酰胺(3a),1-甲基烟酰胺(3b)和1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺 (3c)在训练集中的丰度差异的箱形图。
39.图4为样本按照3个代谢物的丰度分层的主成分分析图。
40.图5为使用3种生物标志物诊断食管癌淋巴结转移情况的roc曲线图，5a为训练集 roc结果，5b为验证集roc结果。
具体实施方式
41.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
42.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
43.下述实施例中研究共包含130例食管癌患者血浆样本，包括43例淋巴结转移患者和 87例淋巴结未转移患者样本。其中淋巴结转移诊断标准是经术后病理报告确认术中淋巴结取样阳性为转移。
44.下述实施例中仪器和试剂如下：
45.表1为实验仪器
[0046][0047]
表2为实验试剂
[0048][0049][0050]
表3为标准品
[0051][0052]
实施例1、血浆代谢物标志物的获得和应用
[0053]
一、血浆代谢物标志物的发现
[0054]
申请人运用单细胞转录组技术对2例发生淋巴结转移的食管鳞癌的肿瘤组织与对应转移淋巴结、3例未发生淋巴结转移的食管鳞癌的肿瘤组织与淋巴结进行单细胞转录组测序。在食管鳞癌淋巴结转移组中，发现与其他细胞类型相比，肿瘤细胞发生明显的代谢重编程(图1a)。进一步，申请人利用非靶向代谢组学技术对13例发生淋巴结转移的食管鳞癌组织、8例未发生淋巴结转移的食管鳞癌组织进行测序分析，针对差异代谢物进行通路分析
发现烟酸和烟酰胺代谢通路在淋巴结转移组与淋巴结非转移组之间具有显著差异(图1b)，而且1-甲基烟酰胺在淋巴结转移组的肿瘤组织中丰度显著升高。
[0055]
评估了烟酸和烟酰胺代谢通路中各个代谢物的检测难易程度和稳定性，选择了1-甲基-6-氧代吡啶-3-甲酰胺、烟酰胺与1-甲基烟酰胺共同作为淋巴结转移的食管鳞癌的候选标志物。
[0056]
二、应用超高效液相色谱质谱联用技术的血浆靶向代谢组学检测方法
[0057]
下面采用130例食管癌患者血浆样本，包括43例淋巴结转移患者(记作转移组、groupa或组a)和87例淋巴结未转移患者样本(记作非转移组、groupb或组b)。
[0058]
血浆样本离心后置于-80℃冰箱内保存。研究时取出血浆样本，经样品预处理后，使用超高效液相色谱质谱联用仪进行靶标代谢组学分析，获得目标代谢物的血浆浓度，用于诊断食管癌淋巴结转移情况，筛选食管癌淋巴结转移标志物。
[0059]
具体操作如下：
[0060]
1、代谢物提取
[0061]
1)将待测血浆样本置于冰上解冻，待解冻完全后涡旋30s；
[0062]
2)取100μl待测血浆样本于1.5mlep管中，加入400μl提取液(体积比，乙腈-甲醇为1:1，-40℃预冷,含一定浓度的同位素内标)；
[0063]
3)涡旋30s混匀，冰水浴条件下超声15min；
[0064]
4)-40℃静置一小时；
[0065]
5)样品4℃，12000rpm(离心力13800(
×
g)，半径8.6cm)离心15min，收集上清液；
[0066]
6)取440μl上清液，氮气吹干，用110μl10％的甲醇水溶液复溶，样品4℃，12000rpm(离心力13800(
×
g)，半径8.6cm)离心15min；取80μl上清液作为待测样本的代谢物，可用于uhplc-ms/ms分析。
[0067]
2、标准溶液配制
[0068]
准确称取相应量的表3所示的标准品于10ml容量瓶中，用10％的甲醇水溶液分别配制成10mmol/l的标准品储备液。
[0069]
取相应量的标准品储备液于10ml容量瓶中，用10％的甲醇水溶液配制成标准溶液，记作不同标准品的校准溶液。
[0070]
用10％的甲醇水溶液依次稀释该校准溶液得到不同标准品的一系列浓度的校准溶液。
[0071]
3、上机检测
[0072]
将上述1获得的来源于各个血浆样本的待测样本或不同标准品的一系列浓度的校准溶液中添加内标溶液(内标名称：nicotinamide-2,4,5,6-d4；厂家和货号：isoreagir-22309；上机浓度：1.6um)，然后进行uhplc-ms/ms检测：
[0073]
1)流动相条件：本项目使用acquityuplc-i/class-tq-s(waters)超高效液相色谱串联质谱仪，通过watersacquityuplchsst3(100
×
2.1mm,1.8μm,waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱a相为含有10mm甲酸铵和0.02％(体积百分含量)甲酸的溶液(溶剂为水，溶质为甲酸铵和甲酸)，b相为甲醇。柱温箱温度为40℃，样品盘设为10℃，进样体积为10μl。
[0074]
2)质谱条件：
[0075]
本项目使用waters xevo tq-s三重四极杆质谱仪，以多反应监测(mrm)模式进行质谱分析。离子源参数如下：capillary voltages＝2.5kv,cone voltages＝30v, desolvation temperature＝550℃,desolvation gas flow＝1100(l/hr),cone gasflow＝150(l/hr),nebuliser gas flow＝7.0(bar)。
[0076]
针对每个目标化合物，选取信号强度最高的数个母离子-子离子对(transition)，对其mrm参数进行优化，并选取其中响应最好的离子对用于定量分析，其它离子对用于目标化合物定性分析。
[0077]
本项目中，所有质谱数据采集及目标化合物定量分析工作，均通过skyline软件来完成。
[0078]
4、校准曲线
[0079]
采用上述3的方法对上述2得到的不同标准品的一系列浓度的校准溶液(0.98 nmol/l、1.95nmol/l、3.91nmol/l、7.81nmol/l、15.63nmol/l、31.25nmol/l、 62.50nmol/l、125.00nmol/l、250.00nmol/l、500.00nmol/l、1000.00nmol/l、 2000.00nmol/l)进行uplc-mrm-ms/ms分析，获得校准曲线。
[0080]
校准曲线y表示目标化合物的峰面积，x表示目标化合物的浓度(nmol/l)。
[0081]
在本发明的这次实验中，1-methylnicotinamide标准曲线公式为 y＝6.5298*10-7
x2+2.1270*10-3
x+8.1473*10-4
；1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide标准曲线公式为y＝-6.8590*10-9
x2+3.5648*10-4
x+6.1525*10-3
；nicotinamide标准曲线公式为y＝-2.8720*10-9
x2+3.2149*10-4
x+4.0703*10-4
。
[0082]
上述标准曲线公式中x为对应物质浓度，单位为nmol/l，y为峰面积。
[0083]
采用最小二乘法进行回归分析，权重设为1/x时，校准溶液回收率(accuracy)和相关系数(r2)最好。若某一校准浓度信噪比(s/n)接近或小于20，或回收率超出80-120％范围，则将该浓度校准点排除。
[0084]
5、方法检出限及定量限
[0085]
将校准溶液依次稀释后的一系列浓度的校准溶液(稀释浓度同4)进行 uhplc-mrm-ms分析，通过其信噪比来计算方法的定量限。方法最低定量限(lloq)定义为信噪比为10时所对应的化合物浓度(us fda guideline for bioanalytical methodvalidation)。
[0086]
6、方法精密度及准确度
[0087]
方法的精密度通过qc样品重复进样的标准相对偏差(rsd)来评估。准确度通过qc 样品的加标回收率(recovery)来评估，测得浓度与加标浓度的百分比值即为加标回收率。
[0088]
二、结果分析获得食管鳞癌淋巴结转移诊断标志物
[0089]
1、食管鳞癌淋巴结转移诊断标志物的鉴定
[0090]
采用上述一中3的方法对上述1得到的待测样本的代谢物进行uhplc-ms/ms检测，获得所有样本中原始代谢指纹图谱。随后对不同组别的靶向代谢物浓度进行分析，以期望获得能够区分食管癌是否淋巴结转移的生物标志物。
[0091]
具体操作如下：
[0092]
1)、色谱分离
[0093]
校准品溶液及样品提取离子色谱图(eics)如图2所示，图2a为校准品溶液的离子色谱图，图2b为1例待测样本的离子色谱图；图中各色谱峰依次见图中示例标注；从中可以
看出：校准品中目标化合物1-methylnicotinamide(图中记作1-m
…
e_4)的响应时间为0.90，峰面积：687937.75；1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide(图中记作1-m
…
e_3)的响应时间为3.27，峰面积：18743962；nicotinamide(图中记作 nic
…
d_1)的响应时间为3.28，峰面积：852123.0625，在待测样本与校准品溶液中的保留时间及色谱峰形均无明显差异。表明，待测样本获得目标化合物 1-methylnicotinamide、1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide和nicotinamide。
[0094]
经过检测，130个待测样本均含有目标化合物1-methylnicotinamide、 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide和nicotinamide。
[0095]
2)、方法定量参数
[0096]
上述待测样本中目标化合物的定量参数见下表4，130例样本中各目标化合物的最低检出限(llods)在0.24
–
4.88nmol/l，最低定量限(lloqs)在0.98
–
39.06nmol/l 之间；所有目标化合物的相关系数(r2)均大于0.9989，说明色谱峰峰面积与化合物浓度间呈良好的定量关系，可满足靶向代谢组学分析的要求。
[0097]
表4为目标化合物的定量参数
[0098][0099]
qc样品的回收率(recovery)及标准相对偏差(rsd)见下表5，qc样品重复进样次数为20次。如表5中所示，所有目标化合物的平均回收率在92.3％
–
103.6％之间，标准相对偏差均小于5.8％。
[0100]
表5为qc样品的回收率(recovery)及标准相对偏差(rsd)
[0101]
目标化合物浓度(nmol/l)回收率rsd1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide1000.00102.5％4.3％1-methylnicotinamide200.0092.3％5.8％nicotinamide200.0099.3％4.0％
ꢀꢀꢀꢀ
[0102]
以上数据表明，本方法能够在以上所示的浓度范围内，准确可靠地检测出样品中的目标代谢物含量。
[0103]
3)、待测样本中目标代谢物的浓度检测结果
[0104]
根据上述一种的3的方法检测待测样本的代谢物含量，再带入上述一.4得到的的校准曲线中，获得浓度c
c值
。
[0105]
样品最终测得浓度cf(final concentration,nmol/l)为仪器直接测得浓度c
c (calculated concentration,nmol/l)乘以稀释因子dil(dilution factor)，单位为nmol/l。稀释因子指的是待测样本在上机检测时的稀释倍数，此项目的稀释因子为 110。
[0106]
样品中目标代谢物浓度cm(metabolite concentration，也称为丰度)等于样品最终测得浓度cf乘以样品最终体积vf(final volume,μl)和样本实验浓缩系数cf，除以样本体积vs(sample volume,μl)(具体公式如下)；单位为nmol/l。
[0107]
计算公式
[0108]
对于本发明的方法，对于本发明的方法，其中即为实验浓缩系数cf。
[0109]
各个待测样本中各目标代谢物的浓度cm定量结果见表6。
[0110]
表6为各个待测样本中各目标代谢物的浓度cm定量结果
[0111]
[0112]
[0113]
[0114][0115]
将上述130例样本中转移组和非转移组中目标化合物浓度取平均值，结果如表7 所示，可以看出，1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide、1-methylnicotinamide、 nicotinamide在转移组和非转移组中有明显差异，进一步证明，这3个标志物可以作为区分食管癌患者是否发生淋巴结转移的标志物。
[0116]
表7为转移组和非转移组的待测样本中各目标代谢物的定量结果
[0117][0118]
实施例2、使用3种食管癌淋巴结转移诊断标志物的应用
[0119]
将130例入组样本按照3：2分为训练集与测试集，其中训练集79例，食管癌淋巴结转移组(group a)26例，食管癌淋巴结非转移组(group b)53例。测试集51 例，食管癌淋巴结转移组(group a)17例，食管癌淋巴结非转移组(group b)34 例。
[0120]
一、训练集
[0121]
训练集79例，食管癌淋巴结转移组(group a)26例，食管癌淋巴结非转移组(groupb)53例。
[0122]
1、代谢物的提取
[0123]
按照实施例1的一的1的方法进行提取，获得不同待测样本的代谢物。
[0124]
2、上机检测
[0125]
按照实施例1的一的3的方法进行uhplc-ms/ms检测，根据实施例1的一的4的方法
(auc＝0.774)，其中灵敏度与特异度分别为58.82％和76.47％。