用于肝癌诊断的KANK2蛋白标志物、试剂盒及应用

用于肝癌诊断的kank2蛋白标志物、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于肝癌诊断的kank2蛋白标志物、试剂盒及应用。


背景技术：

2.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc，以下简称肝癌)是全球第六大最普遍的癌症，也是第三大最常见相关死亡原因的癌症。由于缺乏有效的临床诊断靶标，且肝癌恶性程度极高，侵袭性强，进展迅速，大部分患者就诊时已达中晚期，即使接受规范的系统治疗，中位os往往不超过14个月，导致肝癌仍是死亡率最高的消化系统恶性肿瘤。因此，寻找一些准确的生物标志物在肝癌的诊断或预后中具有重要的临床意义。
3.肿瘤转移是恶性肿瘤的重要特征，也是肿瘤致死的主要原因。原位肿瘤发生侵袭，通过血管或淋巴管迁移至转移靶器官定居与克隆形成，引起肿瘤转移。肿瘤的转移是多因素、多基因相互调控以及与外界环境相互作用的多阶段过程，是肿瘤学研究的重点内容。恶性肿瘤可以发生全身多处转移，恶性肿瘤是否发生转移也是判断肿瘤分期及患者预后的重要指标。
4.研究表明上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，emt)对肿瘤细胞的侵袭、转移及干性特征起到举足轻重的作用。emt可使上皮性肿瘤细胞获得间充质细胞表型，在增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力的同时，也使得肿瘤细胞具有自我更新等干细胞特性。阐明emt与肿瘤转移及干细胞的相互关系及直调控机制，有望为肿瘤的靶向治疗开辟新思路。
5.细胞干性影响癌症起始方向和难易程度，细胞干性与肿瘤转移及增殖能力密切相关，癌干细胞遗传、表观遗传和增殖分裂方式调控能够影响肿瘤增殖能力和恶性程度。此外癌细胞干性基因主要通过调控emt相关通路，影响癌转移。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种用于肝癌诊断的kank2蛋白标志物、试剂盒及应用。本发明通过首次检测kank2蛋白在肝癌组织及配对癌旁组织标本中的表达水平，通过体外及体内试验kank2蛋白对肝癌侵袭、迁移、干性和转移的影响，为肝癌发生与发展的分子机制提供实验基础，为临床应用提供依据。
7.本发明所采用的技术方案为：
8.一种用于肝癌诊断的生物标志物为kank2蛋白。
9.所述kank2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.所述kank2蛋白的核苷酸编码序列如seq id no.2所示。
11.所述肝癌为人原发性肝癌。
12.kank2蛋白作为生物标志物在制备肝癌诊断试剂中的用途。
13.一种肝癌诊断试剂，包括特异性识别kank2蛋白的抗体或抗体片段。
14.kank2蛋白作为生物标志物在制备肝癌检测试剂中的用途。
15.一种试剂盒，包括所述的用于肝癌诊断的生物标志物。
16.一种用于治疗肝癌的药物，包含抑制kank2蛋白过表达的成分。
17.本发明的有益效果为：
18.本发明提供了一种用于肝癌诊断的kank2蛋白标志物，本技术发明人在长期研究中发现，kank2蛋白在肝癌细胞系中呈现出比肝正常细胞中更高的表达量，说明kank2基因的表达水平与肝细胞癌的相关性显著；进一步还发现kank2mrna在癌组织的表达量高于癌旁组织，说明kank2基因及其表达物能够作为肝细胞癌的分子标志物，为肝癌的诊断和靶向治疗提供有效信息。进一步本技术发明人通过细胞实验发现，kank2促进人肝癌细胞体内的转移，kank2促进人肝癌细胞体外的侵袭和迁移，kank2干性在肝癌的发生、发展及转移中起到关键作用，提示kank2在肝癌中发挥癌基因作用。这是首次报道kank2在肝癌组织中的表达以及对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。结合临床组织样本和细胞实验的结果，kank2在肝癌的发展过程中扮演着促癌基因的角色，从而kank2是一个有前景的肝癌生物标记物和有潜力的治疗靶点。kank2能够用于诊断肝细胞癌，为个体化治疗的选择及预后评估提供依据，具有重要临床应用价值。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1a为42例配对的hcc组织和癌旁组织中kank2 mrna的表达水平；
21.图1b为western blot检测42对hcc组织和癌旁组织中8对具有代表性的kank2蛋白的表达水平；
22.图1c为ihc检测hcc组织和癌旁组织中kank2蛋白的表达水平；
23.图2a为transwell实验检测kank2过表达对hcclm3和plc/prf/5细胞侵袭能力的影响；
24.图2b为kank2敲低后对hcclm3和plc/prf/5细胞侵袭能力的影响；
25.图2c为transwell实验检测kank2过表达对hcclm3和plc/prf/5细胞迁移能力的影响；
26.图2d为kank2敲低后对hcclm3和plc/prf/5细胞迁移能力的影响；
27.图3a为western blot实验检测kank2过表达对emt分子表达水平的影响；
28.图3b为western blot实验检测kank2敲低后对emt分子表达水平的影响；
29.图4a为western blot实验检测kank2过表达对干性分子表达水平的影响；
30.图4b为western blot实验检测kank2敲低后对干性分子表达水平的影响；
31.图5a为小鼠尾静脉注射hcclm3-shkank2#1及其对照细胞、plc/prf/5-shkank2#1及其对照细胞，6周后肺转移情况的代表图像；
32.图5b为hcclm3-shkank2#1及plc/prf/5-shkank2#1分别与其对照细胞肺转移模型组织切片he染色结果。
具体实施方式
33.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
34.组织样本
35.收集2018年11月至2020年10月天津市肿瘤医院(天津医科大学肿瘤医院)接受手术切除的42例患者肝癌组织(原发性肝癌)和相应的邻近癌旁组织。手术前所有患者都被告知他们的手术标本可能会被用于研究，均已取得患者书面知情同意，研究方案得到天津市肿瘤医院医学伦理委员会的批准。
36.实施例1
37.1.qrt-pcr检测kank2的表达
38.手术取材的新鲜组织标本，置液氮冷却后于-80℃冷冻冰箱保存。所有肝癌(hcc)组织及癌旁组织剪碎后，用trizol(takara，a-79061)试剂提取组织总rna，根据试剂盒说明书操作将总rna反转录成cdna。反应条件：95℃预变性，酶激活(30s)95℃变性(5s)，60℃(30s)，40个循环。以gadph为内参，以“2-δδct法”计算目的基因kank2 mrna的相对表达量。实验重复3次。
39.kank2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸编码序列如seq idno.2所示。
40.图1a显示了42例配对的hcc组织和癌旁组织中kank2 mrna的表达水平，从图中可以看出：hcc组织中kank2基因表达水平高于癌旁组织。
41.2.构建kank2小干扰病毒干扰载体转染细胞
42.设计特异性的针对kank2的干扰序列，其编码的dna序列如表1所示。
43.表1-针对kank2的干扰dna序列
[0044][0045]
以干扰kank2基因的序列片段作为对照，并将其插入慢病毒载体中(以上载体及片段由吉凯基因公司合成)。将包装好的慢病毒载体感染原发性肝癌细胞株hcclm3细胞和
plc/prf/5细胞，起到下调kank2基因表达的作用，48h后用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系，命名为shkank2#1、shkank2#2(对照为shctrl)。
[0046]
3.western blot实验
[0047]
用细胞裂解液提取细胞中的总蛋白，bca试剂盒(碧云天)严格按说明书操作测蛋白浓度。每孔加入30-50μg标准化蛋白样品，在加满tris-glycine电泳液的垂直电泳槽内，浓缩胶90v恒压电泳至分离胶界面时，调至120v继续电泳至溴酚蓝分离胶底部。转移至聚pvdf膜，用指定的一抗室温孵育2h或4℃孵育过夜。tbst洗10min共3次，加入二抗室温孵育1h。取出pvdf膜，tbst洗10min共3次；吸干膜上液体，加ecl工作液反应2-5min；暗室内压片、显像。以image j软件检测各条带灰度值，以目标条带灰度值与gadph条带灰度值的比值代表各组细胞中kank2及emt、干性分子等蛋白表达水平，结果如图1b、图3a、图3b、图4a、图4b所示。
[0048]
图1b显示了western blot检测42对hcc组织和癌旁组织中8对具有代表性的kank2蛋白的表达水平，从图中可以看出：hcc组织中kank2蛋白表达水平明显高于癌旁组织。
[0049]
图3a和4b显示了western blot检测转染后肝癌细胞emt分子表达水平，从图3a中可以看出：与对照组相比，kank2过表达后hcclm3和plc/prf/5细胞的上皮标志物e-cadherin下调，间充质标志物n-cadherin、vimentin表达上调；从而说明过表达kank2后，促进了肝癌细胞的上皮间质转化；而从图3b中可以看出：与对照组相比，敲低kank2后，hcclm3和plc/prf/5细胞的上皮标志物e-cadherin上调，间充质标志物n-cadherin、vimentin表达下调，从而说明，敲低kank2后，抑制了肝癌细胞的上皮间质转化。
[0050]
图4a和5b显示了western blot检测转染后肝癌细胞干性分子表达水平，从图4a中可以看出：与对照组相比，kank2过表达后hcclm3和plc/prf/5细胞的干性分子表达增强，从而说明过表达kank2后，肝癌细胞干性分子表达水平增加；从图4a中可以看出：与对照组相比，敲低kank2后，kank2敲低后hcclm3和plc/prf/5细胞的干性分子表达水平降低，从而说明敲低kank2后，肝癌细胞干性分子表达水平降低。
[0051]
4.免疫组化实验
[0052]
常规脱蜡水化：脱蜡前，将组织切片放在60℃的恒温箱中，烘烤3h。取出冷却至室温，二甲苯20min
×
2次，无水乙醇
→
95％乙醇
→
85％乙醇
→
75％乙醇，各5min；抗原修复：脱蜡后用清水冲洗2min，微波抗原修复沸腾2min。冷却至室温后，3％h2o2室温孵育10min去除内源性过氧化物酶，pbs冲洗3min
×
3次；滴加一抗，用抗体稀释液稀释一抗，4℃过夜，pbs冲洗3min
×
3次，滴加生物素标记的第二抗体37℃温箱孵育40min；显色、复染：片子从温箱中取出，pbs冲洗3min
×
3次，将切片滴加dab工作液，同时在显微镜下观察控制显色程度，待出现阳性反应，置流水下冲洗及时终止反应；复染：苏木素复染10s，流水冲洗10min；酒精梯度脱水：75％乙醇
→
85％乙醇
→
95％乙醇
→
无水乙醇，各3min；封片：片子放入二甲苯5min，滴加中性树胶，盖玻片封上，封好片子后置于通风柜中晾干。
[0053]
如图1c所示为ihc检测hcc组织和癌旁组织中kank2蛋白的表达水平，数据是3次独立实验的平均值
±
标准差，从图中可以看出：ihc检测发现，kank2蛋白在肝癌组织和癌旁组织中均有表达，而肝癌组织中kank2蛋白表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(p＜0.01，图1c)。
[0054]
通过对比kank2在人肝癌组织和癌旁组织的表达，从而得出，kank2在人肝癌组织
中的表达水平显著高于癌旁组织。
[0055]
实施例2transwell细胞侵袭和迁移实验
[0056]
transwell小室放置于预先制备好人工基底膜(matrigel)基质胶的24孔板中，置于37℃环境中30min，向transwell小室下室中加入含10％胎牛血清培养基。transwell的上室加入用无血清的dmem高糖培养液重悬各组细胞，5％co2、37℃饱和湿度下培养48h。48h后去除下室中的培养液，将小室置于4％的多聚甲醛中固定1h，0.1％的结晶紫溶液染色1h，乙醇脱水，取聚碳酸酯膜置于载玻片上，高倍镜(
×
200)下计数侵袭和迁移细胞数。实验重复3次。
[0057]
肝癌预后差主要和其癌细胞的侵袭和转移密切相关，因此，采用transwell侵袭实验和迁移实验对hcclm3-kank2、plc/prf/5-kank2、hcclm3-shkank2#1、hcclm3-shkank2#2、plc/prf/5-shkank2#1、plc/prf/5-shkank2#2以及对照组hcclm3-kank2shctrl、plc/prf/5-kank2shctrl细胞株的侵袭和迁移能力进行检测。
[0058]
hcclm3-kank2和plc/prf/5-kank2细胞株穿破膜底的细胞数分别明显高于对照组hcclm3-kank2vec、plc/prf/5-kank2vec细胞株，即kank2过表达对hcclm3和plc/prf/5细胞的侵袭和迁移能力增强，差异均具有统计学意义(如图2a、2c所示)，从而说明，kank2促进人肝癌细胞体外的侵袭和迁移。同时，当kank2敲低后，hcclm3-shkank2#1、hcclm3-shkank2#2和plc/prf/5-shkank2#1、plc/prf/5-shkank2#2细胞株穿破膜底的细胞数分别明显低于对照组，即kank2敲低后hcclm3和plc/prf/5细胞的侵袭和迁移能力明显受到抑制，差异均具有统计学意义(如图2b、2d所示)。综上，kank2在肝癌的发生、发展中起到关键作用。
[0059]
实施例3敲减kank2显著抑制肝癌的肺转移
[0060]
建立肝癌肺转移模型。收集病毒转染48h后的hcclm3和plc/prf/5细胞，将4
×
105个低表达kank2的hcclm3、plc/prf/5肝癌细胞系及其对照组细胞通过尾静脉注射到6周龄母裸鼠体内(8只裸鼠/组)；6周以后把裸鼠处死，取肺，在显微镜下数肺表面形成的肿瘤数，并固定、切片、h&e染色。结果显示，抑制kank2显著的减少了肝癌的肺转移(图5a和5b)。小鼠的研究严格按照《实验动物的护理和使用指南》进行的，并得到天津医科大学肿瘤医院实验动物伦理委员会的批准。
[0061]
动物体内实验结果表明，敲减kank2减少了人肝癌hcclm3及plc/prf/5细胞肺转移的发生。
[0062]
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。