高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利异构体的方法与流程

1.本发明涉及的是一种高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利异构体的方法，属于化学检测分析技术领域。


背景技术：

2.精氨酸培哚普利为第三代血管紧张素转换酶抑制剂，服后6小时降压效果最大，作用持续时间长，培垛普利可扩张大、小动脉，减少血容量，降低系统血管阻力、左室充盈压和肺毛细血管楔压，增加心排血量和每搏输出量，增加心脏指数而不改变心率，提高患者运动耐量，减轻左室心肌肥厚，改善血流动力学。本品耐受性好，不引起高血糖，对血脂亦无不良影响。培哚普利服后对ace的抑制较其他ace抑制剂起效慢，对ace的抑制率达90%以上，服后1小时起效，3～4小时达最大药理效应，维持24小时。
3.2018年4月28日，复方制剂（fdc）精氨酸培哚普利10mg/氨氯地平5mg（开素达
®
）正式获国家食品药品监督管理总局（cfda）批准上市。精氨酸盐的加入使培哚普利的保存稳定性增加了约50%。在疗效方面，培哚普利与氨氯地平机制互补，具有协同发挥降压疗效的优势，是降压治疗的“黄金搭档”。培哚普利/氨氯地平fdc半衰期长达30小时，长效作用可以覆盖全天血压。培哚普利/氨氯地平这一组合的心血管益处已经被ascot、europa-ccb等大型临床研究证实，其在降低全因死亡、心血管死亡、总冠脉事件、卒中、新发糖尿病以及肾损伤风险方面均表现出临床优势。
4.在降压类药物中，异构体的存在是影响药效的一大因素，如氨氯地平在初期使用时为混旋体，后期拆分为药效更强的左旋氨氯地平。精氨酸培哚普利中的异构体也是影响产品质量的重要杂质：中国药典、欧洲药典、美国药典等均将其限度定为0.1%。上述参考标准中的方法均为：用适合的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（如inertsil ods3 ；5μm；25cm
×
4.6mm）；以乙腈-正戊醇-0.15%庚烷磺酸钠溶液（用35%的高氯酸溶液调节ph至2.0）（217:3:780）为流动相；检测波长215nm；柱温50℃；检测结果如附图5所示。在该条件下，单针的分析时间长达180分钟，且分离效果受试剂影响较大，各种品牌的离子对试剂对于本品原标准色谱条件的分离度、基线情况干扰较大，对于日常检测造成很大的影响。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决现有精氨酸培哚普利制备和质量检测过程中存在的上述问题，提出一种高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利异构体的方法，并严格进行方法验证，保证方法的科学严谨，满足研发和生产的需求。
6.本发明的技术解决方案：高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利异构体的方法，具体包括如下步骤：1）系统适用性溶液的配制：取精氨酸培哚普利及其立体异构体混合对照品适量，用乙醇-水（1:1）的混合溶剂制成每1ml中含精氨酸培哚普利2mg及精氨酸培哚普利立体异构体0.01mg的溶液，作为系统适用性溶液；
2）供试品溶液的配制：取待测精氨酸培哚普利约20mg，用混合溶剂制成每1ml中含2mg精氨酸培哚普利的溶液，作为供试品溶液；3）对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1ml，用混合溶剂制成每1ml中含0.01mg供试品的溶液，作为对照溶液；4）异构体的液相色谱检测：取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，立体异构体色谱峰及主峰的相互分离度均大于1.5时，再精密量取对照溶液和供试品溶液各10
µ
l注入液相色谱仪，记录色谱图。
7.色谱条件及系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（菲罗门 luna色谱柱，规格150
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4.6mm，填料粒径5μm）；柱温60℃，等度洗脱；采用检测器为紫外检测器；以氨基酸络合物-甲醇（70:30）为流动相，流速为0.8 ml/min，检测波长为220nm，柱温为60℃。
8.氨基酸络合物包括l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-亮氨酸、l-酪氨酸、l-组氨酸与硫酸铜、氯化铜、乙酸铜、硝酸铜中的一种或多种经溶解后混合组成，其浓度为20～50 mmol/l。
9.供试品溶液的色谱图中如显异构体峰，异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍（0.1%）；异构体含量的具体计算公式如下： 。
10.与现有技术相比，本发明的优点在于：采用氨基酸-铜盐络合物对培哚普利及其异构体进行柱前衍生化，扩大其极性差异，从而缩短检测时间，增加检测分离度，提高生产中检测的效率，并为摸索采用手性分离条件打下了基础，降低了生产中的检测成本，延伸了进一步优化条件的可能性。
附图说明
11.附图1是本发明实施例中的系统适用性溶液色谱图。
12.附图2是本发明实施例中的对照溶液色谱图。
13.附图3是本发明实施例中的空白溶剂色谱图。
14.附图4是本发明实施例中的供试品溶液色谱图。
15.附图5是背景技术中现有精氨酸培哚普利异构体检测方法色谱图。
具体实施方式
16.下面根据实施例进一步说明本发明的技术方案。在本说明书的描述中，各实施例的内容意指结合其描述的具体技术特征包含于本发明的至少一个实施方式中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体技术特征可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。
17.综合文献记载，对于手性化合物的分离会采用氨基酸络合物进行衍生化以增大不同手性之间的极性差异，做到辅助液相分离。本发明在考虑到本品为精氨酸盐的基础上，充分筛选了氨基酸-铜盐络合物，在增大极性差异的情况下可以保持较好的基线水平，有利于检测的进行。
18.本实施例中提出的高效液相色谱法测定精氨酸培哚普利异构体的方法，以十八烷
基硅烷键合硅胶为填充剂（菲罗门 luna色谱柱，规格150
×
4.6mm，填料粒径5μm）；柱温60℃，等度洗脱；采用检测器为紫外检测器；以氨基酸络合物-甲醇（70:30）为流动相，流速为0.8 ml/min，检测波长为220nm，柱温为60℃。具体步骤如下：1）系统适用性溶液的配制：取精氨酸培哚普利及其立体异构体混合对照品适量，加乙醇-水（1:1）的混合溶剂制成每1ml中约含精氨酸培哚普利2mg及立体异构体0.01mg的溶液，作为系统适用性溶液；2）供试品溶液的配制：取待测精氨酸培哚普利本品约20mg，用乙醇-水（1:1）的混合溶剂制成每1ml中含2mg的溶液，作为供试品溶液；3）对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1ml，用乙醇-水（1:1）的混合溶剂制成每1ml中含0.01mg的溶液，作为对照溶液；4）异构体的液相色谱检测：取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，立体异构体色谱峰及主峰的相互分离度均大于1.5时，再精密量取对照溶液和供试品溶液各10
µ
l注入液相色谱仪，记录色谱图。得到的系统适用性溶液色谱图、对照溶液色谱图和供试品溶液色谱图分别如图1、图2和图4所示。本实施例中采用的氨基酸络合物具体为l-半胱氨酸与硫酸铜，各30mmol/l。
19.根据中国药典2020年版的要求，对本发明提出的方法进行了方法学验证。有关物质方法学验证结果具体如下：1）专属性可接受的标准：分离度不得小于2.0，主峰的纯度因子应大于980。
20.验证结果：空白溶剂无干扰、主成分峰与异构体峰分离度良好，破坏条件下生成的杂质峰均能与主峰分离，峰纯度均符合要求。详见附图1和附图3。
21.2）检测限定量限可接受的标准：定量限的s/n约为10；检测限的s/n约为3。
22.验证结果：异构体定量限1μg/ml（0.05%），检测限0.5μg/ml（0.025%），检测灵敏度良好。
23.3）线性可接受的标准：回归系数不小于0.999。
24.验证结果：异构体在1～10μg/mlμg/ml范围内呈良好线性（n=5）。
25.4）进样精密度可接受的标准：rsd《2.0%。
26.验证结果：本品标准中的系统适用性溶液、对照溶液、供试品溶液进样精密度均良好。
27.5）重复性可接受的标准：rsd《4.0%。
28.验证结果：重复检测6份样品及相同杂质加样量的样品的结果表明，本品检测方法的重复性良好。
29.6）溶液稳定性可接受的标准：在检测时间内，检测结果不受影响。
30.验证结果：本品系统适用性溶液、对照溶液、供试品溶液均于18h内保持稳定。
31.7）耐用性可接受的标准：在检测条件略微变化时，检测结果不受影响。
32.验证结果：考察了波长
±
2nm、流速相对值变化
±
0.1ml/min、流动相初始比例相对变化
±
4%，柱温变化
±
5℃及不同色谱柱条件下的分析方法的耐用性，结果每个条件下各物质峰的拖尾因子均小于2.0，杂质峰与其他成分峰分离度大于1.5，本方法耐用性良好。
33.上述验证结果表明，本方法的各项指标均符合中国药典2020年版的要求，适宜于检测精氨酸培哚普利的异构体。
34.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
35.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。