一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法及应用与流程

1.本发明涉及药品检测技术领域，具体涉及一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法及应用。


背景技术：

2.硼酸酯类化合物的应用十分广泛，不但可以作为清洗剂中的防锈剂、聚合物添加剂、汽油添加剂、灭菌剂阻燃剂使用，而且可以用作润滑油添加剂和汽车制动液。近年来，含硼酸或硼酸酯结构的化合物在光学、表面工程、催化、储能、自修复材料、生物医学等诸多领域表现出了广阔的应用前景。随着医药行业的迅猛发展，硼酸酯类化合物已成为许多活性药物成分的关键中间体，在医药学中适用于多种生物学活性，例如，n-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷)吡啶-2-基)苯甲酰胺(简称jd1313)是由常州佳德医药科技有限公司研发的一种硼酸酯类化合物，其结构式如下式1所示：
[0003][0004]
目前，对于硼酸酯类化合物的纯度检测尚未制定相关的国家标准或行业标准，相关检测方法的文献报道也很少。由于硼酸酯类化合物遇水不稳定，易水解生成硼酸类化合物，其易水解的本质是因为硼原子为sp2杂化，还存在一个空的p轨道，这个空轨道易于接受水和醇等带有未共用电子对的亲和试剂的进攻而使硼酸酯水解。所以，常规的反相色谱分析无法实现对硼酸酯类化合物的分析分离检测以及制备，硼酸酯类化合物极易在柱内或系统内发生水解。而正相色谱法的操作繁琐，影响因素多，不能作为常规检测方法；若采用气相则对化合物的热稳定性要求较高，且只适用于低沸点的化合物，同样的干扰因素多，存在局限性。
[0005]
针对上述问题，中国专利申请，申请公布号cn108132323a，公布了一种硼酸酯类化合物的非水反相色谱检测方法，其是在反相液相系统中以有机溶剂代替常规水相，其流动相组分均为有机溶剂，采用等度或梯度模式，通过常规c18或石墨化碳色谱柱即可实现对硼酸酯类化合物的有效分离。由于该方法中采用有机溶剂作为流动相体系，洗脱能力很强，化合物保留时间较短，虽然硼酸酯类化合物与水解产物可以完全分离，但与其中间体和未知杂质不能很好的分离，导致无法测定其它杂质的含量。
[0006]
基于上述技术问题，本发明提出一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法，以期解决上述技术问题。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于，克服现有技术中存在的缺陷，提供一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法及应用，依次利用非水反相色谱法检测供试品中硼酸类化合物的含量，利用硼酸酯类化合物在酸性条件下快速水解衍生化反应生成硼酸类化合物的原理，通过含水反相高效液相色谱法测定水解体系中的杂质种类和含量，主成分(硼酸类化合物)与杂质在含水反相高效液相色谱过程中达到较好的分离状态，实现对硼酸酯类化合物纯度的定量检测，可用于硼酸酯类化合物的质量控制。本发明用于检测硼酸酯类化合物jd1313纯度的方法，实现jd1313与各已知杂质的有效分离，空白溶液不干扰测定，操作步骤简单、快速，检测效率高，结果精准度高，为硼酸酯类化合物jd1313的质量控制奠定基础。
[0008]
为实现上述目的，本发明的技术方案之一，设计一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法，包括如下步骤：
[0009]
s1：利用非水反相色谱法检测供试品溶液中硼酸类化合物的含量；
[0010]
s2：将待测硼酸酯类化合物溶解于溶剂中，经衍生化反应生成含有硼酸类化合物的供试品溶液；
[0011]
s3：利用含水反相色谱法检测步骤s2制备的供试品溶液中杂质的种类和含量。
[0012]
优选的技术方案是，所述的步骤s1中，所用的流动相为甲醇/四氢呋喃体系、甲醇/乙腈体系、四氢呋喃/乙腈体系、二氯甲烷/乙腈体系、或四氢呋喃/二氯甲烷体系中的一种。
[0013]
优选的技术方案还有，所述的步骤s2中所用的溶剂和所述的步骤s3中所用的流动相均为有机相-缓冲盐水溶液体系，所用的有机相-缓冲盐水溶液体系中：有机相为甲醇或乙腈中的一种，缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液中的一种，缓冲盐水溶液中溶质的摩尔浓度为5～50mmol/l，缓冲盐水溶液的ph为1.5～3。
[0014]
进一步优选的技术方案还有，所述的有机相-缓冲盐水溶液体系中：有机相为甲醇，缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液，缓冲盐水溶液中溶质的摩尔浓度为10mmol/l，缓冲盐水溶液的ph为2.2。
[0015]
进一步优选的技术方案还有，所述的磷酸盐水溶液为磷酸水溶液、磷酸二氢钾水溶液、磷酸二氢钠水溶液、磷酸氢二钾水溶液、磷酸氢二钠水溶液中的一种。
[0016]
本发明的技术方案之二，提出一种用于检测硼酸酯类化合物jd1313纯度的方法，所述的方法为上述的一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法的应用，包括如下步骤：
[0017]
w1：标准储备液的制备，精密称取待检测目标杂质的对照品，分别用有机溶剂溶解并稀释制成每1ml中含上述对照品1mg的标准储备液；
[0018]
w2：jd1313对照品溶液的制备，精密称取jd1313对照品，用有机相-缓冲盐水溶液体系溶解并稀释制成每1ml中含jd1313对照品1mg的jd1313对照品溶液；
[0019]
w3：样品进行前处理，称取jd1313供试品，用有机相-缓冲盐水溶液体系溶解并稀释制成每1ml中含jd1313 1mg的供试品溶液；
[0020]
w4：采用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物jd1313供试品的纯度：利用非水反相色谱法检测jd1313供试品中硼酸类化合物的含量；然后利用含水反相色谱法检测步骤w3所制备供试品溶液中杂质的种类和含量，所用高效液相色谱仪的检测器为紫外检测器，色谱条件如下：流速：0.8～1.2ml/min；柱温：30～40℃；检测波长：233nm；进样量：20μl；十八
烷基键合硅胶色谱柱；采用线性梯度洗脱的方式，线性梯度洗脱参数如下表1所示，流动相为有机相-缓冲盐水溶液体系，其中流动相a为有机相、流动相b为缓冲盐水溶液体系：
[0021]
表1线性梯度洗脱时间和流动相体积进料比
[0022][0023]
优选的技术方案有，所述的步骤w1中，所用的有机溶剂为甲醇或乙腈。
[0024]
优选的技术方案还有，所述的步骤w2、w3和w4中，所用的有机相-缓冲盐水溶液体系中：有机相为甲醇或乙腈中的一种，缓冲盐水溶液为磷酸水溶液、磷酸二氢钾水溶液、磷酸二氢钠水溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液中的一种，缓冲盐水溶液中溶质的摩尔浓度为5～50mmol/l，缓冲盐水溶液的ph为1.5～3。
[0025]
进一步优选的技术方案还有，所述的有机相-缓冲盐水溶液体系中：有机相为甲醇，缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液，缓冲盐水溶液中溶质的摩尔浓度为10mmol/l，缓冲盐水溶液的ph为2.2。
[0026]
进一步优选的技术方案还有，所述的磷酸盐水溶液为磷酸水溶液、磷酸二氢钾水溶液、磷酸二氢钠水溶液、磷酸氢二钾水溶液、磷酸氢二钠水溶液中的一种。
[0027]
本发明的优点和有益效果在于：
[0028]
1、本发明的一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法，首先利用非水反相色谱法检测供试品溶液中硼酸类化合物的含量，然后利用硼酸酯类化合物在酸性条件下快速水解衍生化反应生成硼酸类化合物的原理，最后通过含水反相高效液相色谱法测定水解体系中的杂质种类和含量，主成分(硼酸类化合物)与杂质在含水反相高效液相色谱过程中达到较好的分离状态，从而实现对
[0029]
硼酸酯类化合物纯度的定量检测，可用于硼酸酯类化合物的质量控制。
[0030]
2、本发明的一种利用反相液相色谱法测定硼酸酯类化合物纯度的方法，成本低廉、经济实用、专属性强、简单快捷、灵敏度高。
[0031]
3、本发明的一种用于检测硼酸酯类化合物jd1313纯度的方法，可以实现jd1313与各已知杂质的有效分离，空白溶液不干扰测定，操作步骤简单、快速，检测效率高，结果精准度高，为硼酸酯类化合物jd1313的质量控制奠定基础。
附图说明
[0032]
图1为最佳色谱条件下系统适用性溶液的液相色谱图；
[0033]
图2为最佳色谱条件下的检测限色谱图；
[0034]
图3为jd1310的标准曲线图；
[0035]
图4为jd1313的标准曲线图；
[0036]
图5为苯甲酸的标准曲线图；
[0037]
图6为jd1312的标准曲线图；
[0038]
图7为混合对照品溶液的稳定性液相色谱图；
[0039]
图8为供试品溶液的稳定性液相色谱图；
[0040]
图9为供试品溶液的稳定性液相色谱图(放大图)。
具体实施方式
[0041]
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0042]
实施例
[0043]
n-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷)吡啶-2-基)苯甲酰胺(简称jd1313)供试品是由常州佳德医药科技有限公司研发的一种硼酸酯类化合物，其与已知杂质的结构式和化学名称参见下表2：
[0044]
表2 jd1313与已知杂质的结构式和化学名称
[0045][0046]
利用本发明的一种用于检测硼酸酯类化合物jd1313纯度的方法对上述的jd1313供试品进行纯度检测，包括如下步骤：
[0047]
一、溶液制备
[0048]
空白溶液：甲醇-磷酸水溶液(％v/v＝50:50)，其中磷酸水溶液的摩尔浓度为10mmol/l、ph2.2
[0049]
jd1310标准储备液：取jd1310约10mg，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为jd1310标准储备液。
[0050]
jd1312标准储备液：取jd1312约10mg，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为jd1312标准储备液。
[0051]
苯甲酸标准储备液：取苯甲酸约10mg，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为苯甲酸标准储备液。
[0052]
对照品溶液：取jd1313对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加5ml甲醇超声溶解，用磷酸水溶液(10mmol/l、ph 2.2)稀释至刻度，制成每1ml中含jd1313约1mg的溶液作为对照品溶液。
[0053]
系统适用性溶液：称取jd1313对照品约10mg置于10ml量瓶中，加5ml甲醇超声溶解后，分别加入jd1312标准储备液、jd1310标准储备液、苯甲酸标准储备液各0.1ml，用磷酸水溶液(10mmol/l、ph 2.2)稀释至刻度，制成每1ml中约含jd1313 1mg、jd1310 10μg、苯甲酸10μg、jd1312 10μg的混合溶液作为系统适用性溶液。
[0054]
jd1313供试品溶液：取jd1313供试品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加5ml甲醇超声溶解，用磷酸水溶液(10mmol/l、ph 2.2)稀释至刻度，制成每1ml中含jd1313约1mg的溶液作为jd1313供试品溶液。
[0055]
混合储备溶液：分别取jd1312标准储备液、jd1310标准储备液、苯甲酸标准储备液、对照品溶液各0.5ml，置于10ml量瓶中，加甲醇稀释制成每1ml中约含50μg的溶液作为混合储备溶液。
[0056]
混合对照品溶液：精密移取混合储备溶液1.0ml，置10ml量瓶中，加4ml甲醇，用磷酸水溶液(10mmol/l、ph 2.2)稀释至刻度，制成每1ml中约含5μg的溶液作为混合对照品溶液。
[0057]
标准曲线溶液：分别取jd1312标准储备液、jd1310标准储备液、苯甲酸标准储备液、对照品溶液用甲醇逐步稀释成浓度为5、25、50、75μg/ml的溶液作为标准曲线溶液。
[0058]
准确度溶液：取jd1313供试品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，作为回收率基质样品。精密移取混合储备溶液0.7ml、1.0ml、1.3ml，分别置于盛有基质样品的3只10ml量瓶中，混匀，用空白溶液稀释至刻度，配制成含杂质70％、100％、130％的溶液，作为准确度溶液。同法平行配制3份。
[0059]
二、液相色谱条件
[0060]
仪器：waters2695高效液相色谱仪(美国waters公司)；
[0061]
分析条件：empower3色谱工作站、自动进样器、柱温箱。色谱柱为shimadzu wondasil c18-wr 4.6*150mm 5μm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃，检测波长：233nm，进样量：20μl，以甲醇为流动相a，磷酸水溶液(10mmol/l、ph 2.2)为流动相b，线性梯度洗脱参数如下表1所示：
[0062]
表1线性梯度洗脱时间和流动相体积进料比
[0063][0064]
三、方法学验证
[0065]
专属性考察：空白溶液对测定无干扰，方法专属性良好。
[0066]
检测限和定量限考察：在本试验条件下，配制不同浓度的jd1310、jd1312、苯甲酸和jd1313对照品溶液，检测限以s/n≥3计，定量限以s/n≥10计，分别进样确定各组份的检测限和定量限，实验结果见表3。
[0067]
表3定量限和检测限
[0068][0069]
溶液稳定性考察：分别取混合对照品溶液(5μg/ml)和jd1313供试品溶液(1mg/ml)，于0～24h进行测定，测定结果见表4和表5。
[0070]
表4混合对照品溶液稳定性
[0071]
放置时间(小时)jd1310峰面积jd1313峰面积苯甲酸峰面积jd1312峰面积03120111308295275332152862313916128259527251215897431474712791452847821479863149151280385278092142148314583129844528290213456103152941301915289142129431231652612914852975721424424318117131703529825209710平均峰面积315014129491528482213819rsd(％)0.571.070.180.89
[0072]
由表4数据结果可知，混合对照品溶液放置24h内稳定。
[0073]
表5 jd1313供试品溶液稳定性
[0074][0075]
由表5数据结果可知，jd1313供试品溶液放置24h内稳定。
[0076]
线性考察：取定量限溶液和标准曲线溶液，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，测定结果见表6～9。
[0077]
表6 jd1313标准曲线测定结果
[0078][0079]
表7 jd1310标准曲线测定结果
[0080][0081]
表8 jd1312标准曲线测定结果
[0082][0083]
表9苯甲酸标准曲线测定结果
[0084][0085]
jd1313线性回归方程为y＝28046x-2960.9，回归系数r为1.000，说明未知杂质在0.6633μg/ml～75.37μg/ml范围内线性良好；jd1310线性回归方程为y＝64134x-13845，回归系数r为1.000，说明jd1310在0.2000μg/ml～75.00μg/ml范围内线性良好；jd1312线性回归方程为y＝42871x-9015.1，回归系数r为1.000，说明jd1310在0.3971μg/ml～74.45μg/ml范围内线性良好；苯甲酸线性回归方程为y＝106295x-4324.1，回归系数r为1.000，说明苯甲酸在0.1008μg/ml～75.60μg/ml范围内线性良好。
[0086]
准确度考察：分别精密量取各准确度溶液20μl，注入液相色谱，记录色谱图，计算回收率，实验结果见表10～12。
[0087]
回收率计算公式：
[0088][0089]
实际回收量＝au×fs
×cs
[0090][0091]
式中：ws为杂质对照品的质量(mg)；cs为杂质对照品的含量(％)；au为供试品溶液中杂质的峰面积(扣除基质中杂质峰面积)；fs为杂质浓度与峰面积比。
[0092]
表10 jd1310回收率测试结果
[0093][0094]
由表10测定数据结果可知，苯甲酸测定平均回收率为101.01％，rsd为0.75％(n＝9)，表明该方法检测杂质jd1310的准确度良好。
[0095]
表11苯甲酸回收率测试结果
[0096][0097]
由表11测定数据结果可知，苯甲酸测定平均回收率为101.75％，rsd为0.82％(n＝9)，表明该方法检测杂质苯甲酸的准确度良好。
[0098]
表12 jd1312回收率测试结果
[0099][0100]
由表12测定结果可见，jd1312测定平均回收率为100.53％，rsd为0.83％(n＝9)，表明该方法检测杂质jd1312的准确度良好。
[0101]
耐用性试验：
[0102]
按照上述的液相色谱条件，通过改变缓冲盐水溶液(磷酸水溶液)ph为2.2
±
0.1、梯度起始比例
±
2％、以及更换不同品牌类似型号的色谱柱来评估测定条件有微小变动时，测定结果不受影响的程度，测试结果参见表13、表14和表15。
[0103]
表13缓冲盐水溶液不同ph的分离度
[0104][0105]
表14不同梯度起始比例的分离度
[0106][0107]
表15不同色谱柱的分离度
[0108][0109]
由表13～15的数据结果可知，通过改变缓冲盐水溶液ph、梯度起始比例、不同品牌类似型号的色谱柱，对jd1313纯度和有关物质测定无明显影响，各组份均能达到良好分离，该方法耐用性强。
[0110]
综上所述，本发明能够有效的分离jd1313和其它杂质，该方法简单、快捷、专属性强、准确度高，是测定jd1313的优选方法。
[0111]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。