一种小儿热咳口服液指纹图谱检测方法与流程

1.本发明涉及一种小儿热咳口服液指纹图谱检测方法，属于中成药检验分析领域。


背景技术：

2.小儿热咳口服液是由蜜麻黄、生石膏、苦杏仁、连翘、大黄、瓜蒌、桑白皮、败酱草、红花、炙甘草十味药提取制成，具有清热宣肺，化痰止咳。用于痰热壅肺证所致的咳嗽，痰黄或候中痰鸣，发热，咽痛，口渴，大便干，小儿急性支气管上述证候者。
3.现行法定标准ybz00452012只有常用的鉴别、含量，为了进一步探索小儿热咳口服液的指标性成分的情况，现采用指纹图谱方法对其相似度进行控制，使药品的质量控制更加全面。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种小儿热咳口服液指纹图谱检测方法，该方法采用高效液相法对样品进行有效分离，10批以上样品拟合对照指纹图谱，采用中药评价系统(2012版)进行评价，相似度要求大于0.90,；进一步提高小儿热咳口服液的控制标准，以保证小儿热咳口服液的质量稳定、均一性。
5.本发明所述的检测方法，包括以下步骤：
6.(a)参照物溶液的制备：取连翘苷对照品适量，加甲醇制成溶液，过滤，即得。
7.(b)供试品溶液的制备：精密吸取样品至容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
8.(c)色谱条件：以十八烷基键合硅胶色谱柱流动相a为水，流动相b为乙腈，进行梯度洗脱，流速0.8～1.2ml/min；柱温15～35℃；检测波长197nm；塔板数以连翘苷计不得低于5000。
9.(d)色谱峰测定：精密吸取上述溶液各10μl，注入色谱仪，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)，进行数据分析，相似度不应低于0.90。
10.作为本发明的优选，所述步骤(a)对照品溶液的制备中，所述连翘苷的浓度为0.04～1mg/ml。
11.作为本发明的优选，所述步骤(b)供试品溶液的制备中，取装量差异项下的供试品溶液，精密吸取1ml至10ml容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
12.作为本发明的优选，所述步骤(c)色谱条件中，以十八烷基键合硅胶色谱柱流动相a为水，流动相b为乙腈，进行线性梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长197nm；塔板数以连翘苷计不得低于5000，其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：
13.0-5min，流动相a所占的体积比为：100％，流动相b所占体积比0％；
14.5-10min，流动相a所占的体积比为：100％
→
95％，流动相b所占体积比0％
→
5％；
15.10-30min，流动相a所占的体积比为：95％
→
90％，流动相b所占体积比5％
→
10％；
16.30-32min，流动相a所占的体积比为：90％
→
85％，流动相b所占体积比10％
→
15％；
17.32-75min，流动相a所占的体积比为：85％，流动相b所占体积比15％；
18.75-80min，流动相a所占的体积比为：85％
→
70％，流动相b所占体积比15％
→
30％；
19.80-85min，流动相a所占的体积比为：70％
→
60％，流动相b所占体积比30％
→
40％；
20.85-90min，流动相a所占的体积比为：60％
→
40％，流动相b所占体积比40％
→
60％；
21.90-95min，流动相a所占的体积比为：40％
→
100％，流动相b所占体积比60％
→
0％；
22.95-100min，流动相a所占的体积比为：100％，流动相b所占体积比0％。
23.最优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
24.色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水为流动相a，流动相b以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长197nm；理论板数以连翘苷计不得低于5000。
[0025][0026]
参照溶液的制备取连翘苷对照品适量，加甲醇制成0.2mg/ml的溶液，过滤，即得。
[0027]
供试品溶液的制备取装量差异项下的供试品溶液，精密吸取1ml至10ml容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
[0028]
测定法精密吸取上述溶液各10μl，注入色谱仪，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)，进行数据分析，相似度不应低于0.90。
[0029]
本发明的检测方法，具备以下有益效果：
[0030]
1.本发明可有效评价药品的批间的稳定性，均一性；
[0031]
2.本发明所建立的高效液相法精密度(rsd为0.5-4.5％)，稳定性(rsd为0.2-3.2％)，重复性性(rsd为1.1-4.4％)，该实验结果表明该检验方法具有测定准确，操作简便，稳定性好的优点。
附图说明
[0032]
图1-为紫外波长扫描
[0033]
图2-为连翘苷对照品溶液液相色谱图；
[0034]
图3-为供试品液相色谱图；
[0035]
图4-为叠加液相色谱图；
[0036]
图5-为对照指纹图谱；
具体实施方式
[0037]
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0038]
在本发明中，考察了供试品处理方法，对照品浓度，流动相比例、精密度、重复性、稳定性、参照物的确认，以及对照指纹图谱的生成。小儿热咳口服液是由江西济民可信药业有限公司提供，方法学验证批号：190902、190903、190904、190905、190906、190907。
[0039]
实施例一、
[0040]
1、波长的选择：精密吸取1ml至50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，取该溶液至紫外检测器中，在190-400nm处进行扫描，结果λ＝197nm处有最大吸收值。因此选择197nm作为检测波长(见附图1)。
[0041]
2、流动相种类选择：因检测波长为197nm，避免甲醇的末端吸收，选择乙腈-水作为流动相。
[0042]
3、流动相比例的选择：经过6种梯度的考察，最终选择上述线性梯度洗脱。
[0043]
4、溶剂选择：以水，50％甲醇，甲醇作为考察条件，结果50％甲醇作为溶剂提取的色谱峰更丰富。因此选择50％甲醇作为溶剂。
[0044]
5、方法学验证：
[0045]
5.1、仪器精密度试验取小儿热咳口服液(批号：190902)，按正文项下进行试验，连续进样6次，记录各共有峰的保留时间和峰面积，结果各共有峰保留时间rsd(n＝6)均小于0.4％，共有峰面积rsd(n＝6)均小于4.5％，表明本方法仪器精密度良好，符合指纹图谱的技术要求。见表1、2。
[0046]
表1精密度试验-保留时间
[0047][0048]
表2精密度试验-峰面积
[0049]
[0050][0051]
5.2、重复性试验取小儿热咳口服液(批号：190902)，按正文项下进行试验，分别吸取6次样品，记录各共有峰的保留时间和峰面积，结果各共有峰保留时间rsd(n＝6)均小于0.5％，共有峰面积rsd(n＝6)均小于4.4％，表明本方法重复性良好，符合指纹图谱的技术要求。见表3、4。
[0052]
表3重复性试验-保留时间
[0053][0054]
表4重复性试验-峰面积
[0055][0056]
5.3、稳定性试验取供精密度试品溶液，在0、4、8、12、24小时注入色谱仪，记录各共有峰的保留时间和峰面积，结果各共有峰保留时间rsd(n＝5)均小于0.5％，共有峰面积rsd(n＝5)均小于3.5％，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好，符合指纹图谱的技术要求。见表5、6。
[0057]
表5稳定性-保留时间
[0058][0059]
表6稳定性-峰面积
[0060][0061]
5.4、对照图谱的建立：
[0062]
取2018-2019年度江西济民可信药业生产的小儿热咳口服液13批样品依照正文进行试验，结果5批出现共有峰偏小及缺失，因此选择8批作为对照图谱的叠加(见附图4)，对照图谱生成参数为时间窗口1min，中位数法。生成对照指纹图谱(见附图5)。
[0063]
5.5、参照物的确认：
[0064]
取处方的10味药材指标成分进行指认，发现连翘苷对照品与峰9保留时间一致，同时紫外光谱也一致。因此确认为峰9为连翘苷，如图2、3。
[0065]
5.6、样品的测定：
[0066]
对3批样品进行检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)，分别倒入样品、对照图谱，进行数据分析，结果相似度均大于0.90。见表7。
[0067]
表7样品相似度测定
[0068][0069][0070]
实施例二、色谱条件的筛选-流动相的选择，
[0071]
供试品溶液的最大吸收波长为197nm，且在197nm处色谱峰较丰富，考虑到甲醇在200nm以下有末端吸收，选择了水(a)-乙腈(b)作为流动相；经过下面6种梯度的考察，梯度6各峰分离度》1.5。最终选择上述线性梯度洗脱。
[0072]
梯度1：
[0073][0074]
梯度2
[0075][0076]
梯度3
[0077][0078][0079]
梯度4
[0080][0081]
梯度5
[0082][0083]
梯度6
[0084][0085][0086]
实施例三、本发明的检测方法
[0087]
(a)参照物溶液的制备：取连翘苷对照品适量，加甲醇制成溶液，过滤，即得，溶液中连翘苷的浓度为0.1mg/ml，
[0088]
(b)供试品溶液的制备：精密吸取样品至容量瓶中，精密吸取到5ml容量瓶中，加
50％甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得，
[0089]
(c)色谱条件：以十八烷基键合硅胶色谱柱流动相a为水，流动相b为乙腈，进行梯度洗脱，流速0.8ml/min；柱温25℃；检测波长197nm；塔板数以连翘苷计不得低于5000；
[0090]
(d)色谱峰测定：精密吸取上述溶液各10μl，注入色谱仪，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)，进行数据分析，相似度不应低于0.90。
[0091]
其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：
[0092]
0-5min，流动相a所占的体积比为：100％，流动相b所占体积比0％；
[0093]
5-10min，流动相a所占的体积比为：100％
→
95％，流动相b所占体积比0％
→
5％；
[0094]
10-30min，流动相a所占的体积比为：95％
→
90％，流动相b所占体积比5％
→
10％；
[0095]
30-32min，流动相a所占的体积比为：90％
→
85％，流动相b所占体积比10％
→
15％；
[0096]
32-75min，流动相a所占的体积比为：85％，流动相b所占体积比15％；
[0097]
75-80min，流动相a所占的体积比为：85％
→
70％，流动相b所占体积比15％
→
30％；
[0098]
80-85min，流动相a所占的体积比为：70％
→
60％，流动相b所占体积比30％
→
40％；
[0099]
85-90min，流动相a所占的体积比为：60％
→
40％，流动相b所占体积比40％
→
60％；
[0100]
90-95min，流动相a所占的体积比为：40％
→
100％，流动相b所占体积比60％
→
0％；
[0101]
95-100min，流动相a所占的体积比为：100％，流动相b所占体积比0％。
[0102]
实施例四、小儿热咳口服液的配方及制备方法
[0103]
处方：麻黄(蜜炙)60g、生石膏200g苦杏仁120g、连翘200g、大黄40g、瓜蒌120g、桑白皮120g、败酱草200g、红花120g、甘草(蜜炙)60g
[0104]
制法：以上十味，加十倍量水，煎煮三次，每次1小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.10～1.20(600c)，加乙醇使含醇量达65％，搅匀，静置24小时，取上清液，回收乙醇至无醇味。加水400ml，冷藏，滤过，煮沸，加入蔗糖150g，搅匀，加水调整总量至1000ml，搅匀，静置，滤过，灌封，灭菌，即得。