一种基于钴基类氧化酶活性动态时间比色测定总抗氧化能力的方法

1.本发明属于抗氧化剂检测技术领域，具体涉及一种基于钴基类氧化酶活性动态时间比色测定总抗氧化能力的方法。


背景技术：

2.抗氧化剂是可以阻止氧气不良影响的物质，通过消耗中和生物体内代谢产生的活性氧物种，保护细胞和器官免受氧化。抗氧化剂常被应用于食品添加剂，防止或延缓食品氧化提高食品的稳定性和延长贮存期；也被应用于化妆品领域，阻止自由基对细胞组织损伤，延缓皮肤衰老。其中不同成分的抗氧化剂具有不同的抗氧化能力，目前常用总抗氧化能力（tac）评估抗氧化能力。
3.纳米酶相较于天然酶具有稳定性好、成本低、适应范围广等优势，在tac检测领域表现出较大的潜力。目前报道的大多基于具有类氧化物酶活性的纳米酶催化氧化显色底物，而抗氧化剂可抑制该显色反应从而利用紫外-可见吸收光谱可实现tac的测定。然而，该催化显色反应通常采用测量波长扫描下吸光强度数值，该波长扫描方法受限于需要实验室的大型仪器设备。针对上述问题，我们测量固定波长下达到相同吸光强度数值所需要的时间，该固定波长在可见光范围内，达到吸光强度数值可以转换成rgb颜色数值，根据达到不同rgb颜色数值所需时间实现检测，该方法终端检测数字化、可视化、便携化。


技术实现要素：

4.针对目前利用纳米酶测定tac的方法大多需要使用过氧化氢，利用紫外可见吸收光谱波长扫描对比吸光强度的方法，测定抗氧化能力。我们发展了一种基于时间动态扫描，在此基础上开发比对颜色rgb数值与反应时间的方法，测定抗氧化能力。该方法无需使用过氧化氢，脱离特定检测设备仅需秒表比色完成，操作更为简单。跟进一步地，可将颜色转化为rgb数值建立标准比色库，实现终端检测数字化、可视化、便携化，具有潜在的商业价值。
5.检测机理如下：co-nc氧化酶具有类氧化物酶活性，直接催化溶解氧变成活性氧物种，使得无色tmb变成蓝色tmb，在紫外可见光谱652nm处有明显吸收峰；抗氧化剂可以直接消耗活性氧物种，延长无色tmb开始显色时间。随时间变化，显色程度加深对应rgb数值变化。基于测定起始反应时间随抗氧化剂浓度的变化，可实现抗氧化剂的检测。进一步将该体系用于化妆品中tac测定。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：制备co/nc纳米酶，利用co/nc纳米酶测定不同浓度的抗氧化剂的紫外光谱，记录溶液达到不同吸光度所需的时间及相应的颜色，使用颜色识别软件测量记录下溶液颜色的rgb值，获取tmb显色反应吸光强度与颜色程度对应关系；实际样品测量时记录达到该rgb颜色的反应时间，可以实现tac的时间比色检测。
7.一种基于钴基类氧化酶活性动态时间比色测定总抗氧化能力的方法，包括以下步
骤：（1）制备co/nc纳米酶；（2）抗氧化剂的测定：向1.5 ml离心管中依次添加880 μl醋酸盐缓冲液（0.2 m，ph = 3.2），20 μl co/nc纳米酶（0.2 mg/ml），50 μl tmb（5 mm）和50 μl不同浓度的抗氧化剂，混合均匀后，孵育10分钟后测试紫外光谱；（3）动态比色对比的实现：采集混合溶液在波长652nm处时间扫描收集到的吸光度强度，记录溶液达到不同吸光度所需的时间及相应的颜色。使用颜色识别软件测量记录下溶液颜色的rgb值，获取tmb显色反应吸光强度与颜色程度对应关系；比对后发现在吸光度强度达到0.2时捕获相应的rgb颜色最为敏感，记录其对应时间，可以实现tac的时间比色检测；（4）tac测定：直接用水将待测样品稀释到抗氧化剂的线性范围内进行测试。
8.优选地，步骤（1）中co/nc纳米酶的制备方法为：向30ml甲醇加入0.488g的六水合硝酸锌和0.068g的六水合硝酸钴，充分混匀后接着向烧瓶中加入15ml溶有0.616g二甲基咪唑的甲醇溶液。剧烈搅拌半小时后将溶液在120℃下水热反应4小时；离心洗涤干燥，所得干燥粉末置于管式炉中，氩气环境下950℃下煅烧3小时；煅烧后得到黑色粉末置于室温下保存即可。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜表征所制备的co/nc纳米酶。
9.优选地，所述的抗氧化剂为l-抗坏血酸和谷胱甘肽。
10.优选地，步骤（2）中所述的波长为652 nm。
11.有益效果（1）该方法无需使用昂贵大型仪器适用范围广，无需使用过氧化氢，环境适宜性好，易于推广。
12.（2）该方法设计的纳米酶为过渡金属材料，价格便宜，稳定性好，可以大量制备。
13.（3）该方法将仪器测量的波长-强度信号转换为时间-颜色信号继而转换为时间-数字信号，采集时间-颜色信号更为便捷性，数字化解决了不同个人识别颜色敏感能力差异化的问题。
14.（4）该方法可结合具有图像采集功能的移动终端，实现比色对比检测，实现了终端检测数字化、可视化、便携化。
附图说明
15.图1 （a）co/nc的扫描电子显微镜图；（b）co/nc的透射电子显微镜图；图2 （a）波长扫描下加入不同浓度aa的紫外可见光吸收光谱，从上到下aa的浓度依次为0、5、10、15、20、30、40、50μm；(b) 反应体系在652 nm处吸光度与aa浓度的线性关系；图3（a）时间扫描下加入不同浓度aa的紫外可见光吸收光谱，从左到右aa的浓度依次为0、5、7.5、10、15、20、30、40μm；(b) 反应体系在652 nm处吸光度到达0.2所需的反应时间与aa浓度的线性关系；图4 tmb显色变化趋势的颜色选择标准以及对应rgb颜色转换值，从左到右分别为不同tmb显色程度以及对应颜色的rgb数值，其中颜色2数值区分最明显；图5时间检测tac应用在水、aa、gsh以及三种护肤品溶液；图6 动态检测tac效果示意图。
具体实施方式
16.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
17.实施例1（1）co/nc的制备及表征：co/zn-zif的制备：向30ml甲醇加入0.488g的六水合硝酸锌和0.068g的六水合硝酸钴，充分混匀后接着向烧瓶中加入15ml溶有0.616g二甲基咪唑的甲醇溶液；剧烈搅拌半小时；将溶液在120℃下水热反应4小时；离心洗涤干燥。
18.co/nc的制备：将co/zn-zif粉末置于管式炉中，氩气环境下950℃下煅烧3小时；煅烧后得到co/nc黑色粉末，置于室温下保存即可。
19.利用透射电子显微镜、紫外-可见吸收光谱表征所制备的co/nc纳米酶。从图1透射电子显微镜表征结果可以看出所制备纳米酶尺寸在200-500nm左右，高分辨电镜表征结果可以看出分布均匀。这表明我们合成了分布均匀的co/nc纳米酶。
20.（2）抗氧化剂的测定：向1.5 ml离心管中依次添加880 μl醋酸盐缓冲液（0.2 m，ph = 3.2），20 μl co/nc纳米酶（0.2 mg/ml），50 μl tmb（5 mm）和50 μl不同浓度的抗氧化剂（l-抗坏血酸），混合均匀后，孵育10分钟后测试紫外光谱，波长为652 nm。co/nc在酸性环境中可以催化溶解氧生成具有强氧化性的活性氧物种，抗氧化剂可以与之反应进而推迟tmb氧化显色反应。如图2，随抗氧化剂aa浓度不断增加，652nm处吸光度逐渐降低，对抗氧化剂的浓度进行线性拟合，得到aa的线性范围为0-50μm，检出限为2.81 μm。
21.（3）动态比色对比的实现：如图3收集了加入不同浓度aa的混合溶液在波长652nm处时间扫描的紫外可见光吸收光谱，记录溶液达到不同吸光度所需的时间及相应的颜色。图4中使用颜色识别软件photoshop拾色器测量记录下溶液颜色的rgb值，经比对在吸光度强度达到0.2时捕获相应的rgb颜色最为敏感。实际样品测量时记录达到该rgb颜色的反应时间，可以实现tac的时间比色检测。
22.（4）tac测定：如图5分别测定了水、aa、gsh以及3种化妆品的tac。化妆品用水稀释到aa的线性范围内进行测试。tac以每升含aa的毫摩尔当量表示。具体测试方法如同aa的检测，动态检测tac效果示意图见图6。