一种组合检测的心肌标志物快速检测试剂盒及其应用的制作方法

1.一种组合检测的心肌标志物快速检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.免疫学检测技术是应用免疫学原理设计的测定抗原、抗体、免疫细胞及化学成分等的实验手段，广泛用于来源于人体和动物体可进行疾病诊断和健康检测的样品以及用于环境、药物分析、食品和工业分析的样品。常用的有免疫化学发光法、酶联免疫法、荧光免疫层析法、胶体金免疫层析法、乳胶免疫层析法等。血液心肌标志物检测是临床常用的检测手段，常用的心肌标志物有心肌肌钙蛋白i、心肌肌钙蛋白t、心型脂肪酸结合蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、髓过氧化酶、n端脑利钠肽前体等。对于心肌标志物的临床检测，通常要求检测速度越快越好，从采样到出结果时间应该控制在10分钟以内，但现有的检测都无法满足这个要求目前，心肌标志物的临床检测主要采用免疫学检测技术，包括胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法和免疫化学发光检测等。化学发光检测时间之前需要3小时以上，经过多方面的技术改进，现在已缩短至20多分钟。胶体金免疫层析检测从1998年肌钙蛋白t快速检测试剂盒问世以来，陆续开发了多种产品，但检测时间均在15-20分钟左右，即从采样到出结果的时间均大于20分钟。因此，开发具有高灵敏度、快速、小型化、全定量、自动化且操作简便、使用快捷，且检测时间在10分钟以内的心肌标志物快速检测技术产品，利于提高医疗质量和效率，具有重要的临床意义和应用价值。


技术实现要素：

3.本发明的目的是开发一种检测时间控制在10分钟以内的心肌标志物快速检测技术产品，与现有技术比较，具有检测灵敏度高、快速、成本低等优点，以提高临床检测质量。
4.针对上述目的，本发明提供的一种组合检测的心肌标志物快速检测试剂盒，其特征在于，包括：检测扣卡（1）、心肌标志物特异性试剂条（2）、心肌标志物特异性免疫检测标记物（3）、免疫检测管（4）、稀释液（5）、稀释液管（6）和定量检测仪（7），其中：所述检测扣卡（1）、所述免疫检测管（4）、所述稀释液管（6）和定量检测仪（7）为独立设置的不同的组合结构；所述检测扣卡（1）包括检测外壳（8）和位于所述检测外壳（8）内的所述心肌标志物特异性试剂条（2）；所述心肌标志物特异性试剂条（2）由支撑底片（9）和在支撑底片（9）上依次粘贴的包被有心肌标志物特异性的抗人心肌标志物第二抗体的硝酸纤维素膜（10）和吸水纸（11）组成；所述心肌标志物特异性免疫检测标记物（3）为用指示剂标记的抗人心肌标志物第一抗体，装载于所述免疫检测管（4）内，所述指示剂为彩色微球，包括胶体金微粒、乳胶微粒的至少一种；所述稀释液（5）为水溶性缓冲盐溶液，装载于所述稀释液管（6）内；所述定量检测仪器（7）为所述心肌标志物快速检测试剂盒的定量检测单元，包括色度定量分析仪和荧光定量分析仪的至少一种；所述检测外壳（8）包括上层结构（12）和下层结构（13），所述上层结构（12）上设置有加样孔（14）和观察窗（15），所述下层结构（13）设置有放置所述心肌标志物特异性试剂条（2）的托槽（16），其中所述加样孔（14）对
应硝酸纤维素膜（10）近端，观察窗（15）对应所述硝酸纤维素膜（10）中远端。
5.所述硝酸纤维素膜包括硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、deae纤维素膜的一种或多种组合。
6.上述组合检测结构中，所述支撑底片（9）上粘贴有血细胞过滤结构（19），与所述硝酸纤维素膜（10）的近端相连接，所述血细胞过滤结构（19）包括血细胞过滤膜或经红细胞抗体处理的膜垫的至少一种。
7.上述组合检测结构中，所述检测试剂条的支撑底片（9）上粘贴有液相分散膜（20），与硝酸纤维素膜的近端相连接，其中液相分散膜（20）优选玻璃纤维素膜或多聚酯纤维素膜，所述加样孔所对应的检测试剂条的位置为所述液相分散膜。
8.上述组合检测结构中，所述心肌标志物快速检测试剂盒配置有的定量检测仪器（7），包括色度定量分析仪、荧光定量分析仪的至少一种。
9.上述组合检测结构中，所述心肌标志物包括心肌肌钙蛋白i、心肌肌钙蛋白t、心型脂肪酸结合蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、髓过氧化酶、n端脑利钠肽前体的至少一种。
10.上述组合检测结构中，所述心肌标志物快速检测试剂盒的操作使用，采用血细胞过滤膜结构模式，包括如下步骤：1）取出含有血细胞过滤膜的检测扣卡，水平放置于台面；2）采集待检血液样本加入含有所述抗人心肌标志物第一抗体免疫检测标记物（3）的免疫检测管（4）内，并加入适量的稀释液，混合，制成待检样本混合液；3）将待检样本混合液经加样孔加至血细胞过滤膜，向前流经血细胞过滤膜、硝酸纤维素膜、吸水垫；4）取稀释液经加样孔加至血细胞过滤膜，向前流经血细胞过滤膜、硝酸纤维素膜、吸水垫；5）从观察窗口检测读取结果，完成检测。
11.如权利要求1所述心肌标志物快速检测试剂盒在人心肌标志物免疫检测试剂产品开发中的应用。
12.本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明将心肌标志物的免疫检测扣卡从现有的样本垫、标记物结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸垫缩减为仅用硝酸纤维素膜和吸水纸垫完成检测反应，不仅降低了检测成本，同时缩短了检测时间，实现检测时间控制在10分钟以内的目的，有效提高心肌标志物临床检测完产品临床检测的及时性和普及推广的可行性，提高临床诊治效果。
13.2、本发明心肌标志物检测扣卡在硝酸纤维素膜的前面贴加血细胞过滤膜或经红细胞抗体处理的膜垫结构，可以同时用于全血的一步性检测，进一步缩短了样本处理时间，加快了检测速度和检测使用的便捷性和实用性；3、本发明心肌标志物检测扣卡采用首先加载含有免疫检测标记物的待检样本混合液，然后再加载不含有免疫检测标记物的稀释液的分步的结构使用状态，不仅提高了被检物质在硝酸纤维素膜上的结合效率，同时发挥清洗作用，有效降低免疫检测标记物在硝酸纤维素膜上的非特异性结合，提高检测效率。
14.4、本发明心肌标志物检测扣卡设置了同时包括色度定量分析仪、荧光定量分析仪的至少一种的定量检测仪，可用于多种环境下的免疫定量检测，提高了临床应用价值。
15.附图说明
16.图1为本发明的整体结构切面示意图；图2为本发明的整体结构示意图；图3为本发明的试剂条基本结构示意图；图4为本发明的试剂条含有血细胞过滤结构示意图；图5为本发明的试剂条含有液相分散膜结构示意图；图6为本发明的免疫检测管示意图；图7为本发明的稀释液管示意图；图8为本发明的定量检测仪。
17.图中标记如下：检测扣卡1；心肌标志物特异性试剂条2；免疫检测标记物3；免疫检测管4；稀释液5；稀释液管6；定量检测仪器7；层析检测外壳8；支撑底片9；硝酸纤维素膜10；吸水垫11；检测扣卡上盖12；检测扣卡底座13；加样孔14；观察窗15；试剂条托槽16；检测线（捕获剂）17；质控线18；血细胞过滤结构19；液相分散膜20；免疫检测标记物管盖21；免疫检测标记物加样头22；稀释液管盖23；稀释液装载加样头24；定量检测腔室25。
18.具体实施方式
19.为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下所述实施例结合附图对本发明进行进一步说明，但本发明并不局限于以下说明。
20.如图1、图2、图3所示，本发明心肌标志物组合检测结构的整体结构包括检测扣卡1、心肌标志物特异性试剂条2、免疫检测标记物3、免疫检测管4、稀释液5、稀释液管6、定量检测仪器7、层析检测外壳8、支撑底片9、硝酸纤维素膜10、吸水垫11、检测扣卡上盖12、检测扣卡底座13、加样孔14、观察窗15、试剂条托槽16、检测线（捕获剂）17、质控线18，其中检测扣卡1包括层析检测外壳8和位于层析检测外壳8内的心肌标志物特异性试剂条2，心肌标志物特异性试剂条2有支撑底片9和粘贴于支撑底片9上的硝酸纤维素膜10和吸水垫11；层析检测外壳8包括检测扣卡上盖12和检测扣卡底座13以及检测扣卡上盖12上的加样孔14和观察窗15，以及检测扣卡底座13上设置的试剂条托槽16以及设置于试剂条托槽16上的心肌标志物特异性试剂条2；组合检测结构的免疫检测标记物3、免疫检测管4、稀释液5、稀释液管6和定量检测结构7为与检测扣卡1分立设置而组合使用的结构部件，其中免疫检测标记物（抗人心肌标志物第一抗体标记物）3装载于免疫检测管4内，稀释液5装载于稀释液管6内，定量检测仪器7为分立的定量检测装置，使用时首先将免疫检测标记物3在免疫检测管4内与待检样本混合，经加样孔14加载至所述硝酸纤维素膜10的起始端，流经所述硝酸纤维素膜10和吸水垫11，待检物被包被固定在所述硝酸纤维素膜10上的捕获剂（检测线，非标记的抗人心肌标志物第二抗体）17所特异性捕获固定；然后加载不含有所述免疫检测标记物3和待检样本的稀释液5至硝酸纤维素膜10的起始端，加载一次或多次，清除残留在硝酸纤维素膜10上未被特异性结合的所述指示剂；用定量检测仪器7检测硝酸纤维素膜10上所述免疫
检测标记物3被捕获的量，读取检测结果，完成检测过程。
21.如图3所示，本发明的心肌标志物特异性试剂条基本结构，pvc支撑底片9上由近及远依次粘贴有硝酸纤维素膜10和吸水垫11，硝酸纤维素膜10上包被有用于待检物捕获的检测线（捕获剂，非标记的抗人心肌标志物第二抗体）17和质控线18。
22.如图4所示，本发明的心肌标志物特异性试剂条含有血细胞过滤结构，pvc支撑底片9上由近及远依次粘贴有血细胞过滤膜19、硝酸纤维素膜10和吸水垫11，这样检测扣卡1、免疫检测管4和稀释液管6为组合使用状态时，首先将指示剂标记的抗人心肌标志物第一抗体标记物-免疫检测标记物3与待检血液样本混合，加载至血细胞过滤膜19，过滤血细胞，血浆部分流经硝酸纤维素膜10和吸水垫11，待检血液样本中的心肌标志物被包被固定在硝酸纤维素膜10上的抗人心肌标志物第二抗体（捕获剂）11所特异性捕获固定；然后加载不含有所述免疫检测标记物和待检样本的稀释液至血细胞过滤膜19，加载一次或多次，清除残留在硝酸纤维素膜10上未被特异性结合的指示剂；用定量检测结构7检测硝酸纤维素膜上免疫检测标记物被捕获的量，读取检测结果，完成检测过程。
23.如图5所示，本发明的心肌标志物特异性试剂条含有液相分散膜结构，pvc支撑底片9上由近及远依次粘贴有液相分散膜20、硝酸纤维素膜10和吸水垫11，这样检测扣卡1、免疫检测管4和稀释液管6为组合使用状态时，首先将指示剂标记的抗人心肌标志物第一抗体标记物-免疫检测标记物3与待检样本混合，加载至液相分散膜20上，流经硝酸纤维素膜10和吸水垫11，待检样本中的心肌标志物被包被固定在硝酸纤维素膜10上的抗人心肌标志物第二抗体（捕获剂）11所特异性捕获固定；然后加载不含有所述免疫检测标记物和待检样本的稀释液至液相分散膜20上，加载一次或多次，清除残留在硝酸纤维素膜10上未被特异性结合的指示剂；用定量检测结构7检测硝酸纤维素膜上免疫检测标记物被捕获的量，读取检测结果，完成检测过程。
24.如图6所示，本发明的免疫检测管，包括指示剂标记的抗人心肌标志物第一抗体标记物-免疫检测标记物3、免疫检测标记物管4、免疫检测标记物管盖21、免疫检测标记物加样头22，其中免疫检测标记物3优选冻干粉剂，在检测前加入待测样本，混合为待检样本混合物。
25.如图7所示，本发明的稀释液管，包括稀释液5、稀释液管6、稀释液管盖23、稀释液装加样头24，使用时稀释液5被直接加载至试剂条上。
26.如图8所示，本发明的定量检测装置，包括定量检测结构7和位于结构内的放置检测扣卡的定量检测腔室25。
27.这样在实际操作时，本发明组合检测结构所述的检测扣卡1、心肌标志物特异性试剂条2、免疫检测标记物3、免疫检测管4、稀释液5、稀释液管6和定量检测结构7为一体化组合使用结构，使用时将免疫检测标记物3在免疫检测管4内与待检样本混合，经加样孔14加载至所述硝酸纤维素膜10的起始端，流经所述硝酸纤维素膜10和吸水垫11，待检物被包被固定在所述硝酸纤维素膜10上的捕获剂（检测线，非标记的抗人心肌标志物第二抗体）17所特异性捕获固定；然后加载不含有所述免疫检测标记物3和待检样本的稀释液5至硝酸纤维素膜10的起始端，加载一次或多次，清除残留在硝酸纤维素膜10上未被特异性结合的所述指示剂，将清洗后的硝酸纤维素膜10放入位于定量检测装置的定量检测腔室24内，启动检测，捕获固定于硝酸纤维素膜10上免疫检测标记物3的量被定量检测，读取检测结果，完成
检测过程。
28.本发明的实验研究：下述实验说明本发明的检测方法及其效果，但不是对本发明的限定。下述实验中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.实验一：免疫胶体金法检测血液人肌红蛋白的比对实验：一、本发明组合检测结构实验用材料：检测扣卡采用市售的有上盖和底座的检测扣卡，实验用2ml保存管作为免疫检测管和稀释液管，硝酸纤维素膜采用赛多利斯cn140，血细胞过滤膜采用whatman的fusion 5，玻璃纤维素膜采用上海金标的sb08，色度定量分析仪采用欧普兰skanflexi多通道免疫层析定量分析仪，印膜仪采用美国imagen technology公司的isof flow喷膜印膜一体机，冷冻干燥机采用上海力辰公司的lc-10n冷冻干燥机，切条机采用韩感中国ce切条机。
30.二、免疫检测标记物制备：采用常规免疫胶体金标记及双抗体夹心法检测方法，以胶体金微粒标记抗人肌红蛋白第一单克隆抗体作为免疫检测标记物，以对人肌红蛋白具有与抗人肌红蛋白第一单克隆抗体配对的特异性免疫结合特性的抗人肌红蛋白第二单克隆抗体作为捕获剂，以非标记状态包被在硝酸纤维素膜上，通过免疫检测标记物结合人肌红蛋白，流经硝酸纤维素膜与捕获剂结合并捕获固定，通过测定胶体金标记物的捕获量，计算样本抗原浓度。具体操作：取1.5ml离心管，加入粒径60nm胶体金溶液1ml，加入3.6ul 0.1m碳酸钾，搅拌均匀，加入抗人肌红蛋白第一单克隆抗体10ug，反应10min后，加入20%bsa 10ul/ml，再反应10min后，用10000r/min 离心15分钟，去上清，沉淀用1ml胶体金复溶液（30mm tris、3%海藻糖、3%蔗糖、0.25% bsa）混悬，10000r/min 离心15分钟，去上清，沉淀再次用胶体金复溶液混悬，终体积为0.5ml。
31.三、试剂条制备：常规对照组：在pvc支撑底片上依次粘贴胶体金结合垫、血细胞过滤膜、硝酸纤维素膜和吸水纸。将胶体金标记物包被在玻璃纤维素膜胶体金结合垫上，启动印膜仪，开启加压氮气，装载胶体金标记物溶液，开始喷膜包被，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 5.0μl／cm；将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥６小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。检测线t的捕获抗体为1.0mg/ml的非标记配对抗人肌红蛋白第二单克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜的中段；质控线c为1.0mg/ml的羊抗鼠igg多克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜的远端，用于捕获未被特异性捕获的胶体金标记抗人肌红蛋白单克隆抗体。
32.本发明实验组：在pvc支撑底片上依次粘贴血细胞过滤膜、硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明实验组将胶体金标记物2.0μl／管分装至2ml保存管内，冻干，4℃保存使用。检测线t的捕获抗体为1.0mg/ml的非标记配对抗人肌红蛋白第二单克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜的中段；质控线c为1.0mg/ml的羊抗鼠igg多克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜的远端，用于捕获未被特异性捕获的胶体金标记抗人肌红蛋白单克隆抗体。
33.试剂条制备：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，置粘贴好的检测片于切条机上，切成 4.0mm试剂条。将试剂条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签备用。
34.四、实验方法：人肌红蛋白溶液的配制：取已知浓度的人肌红蛋白溶液，用样品稀释缓冲液（1%bsa，100mm 甘氨酸，50mm pbs, 150mm nacl，ph7.4）稀释配置100ng/ml的人肌红蛋白溶液。
35.实验组：将上述配制的人肌红蛋白溶液，以50ul/管加入上述制备的胶体金标记物管内，形成标记物混合液。取上述制备的本发明试剂条，向血细胞过滤膜上滴加配制的标记物混合液50ul，静置1分钟，再向血细胞过滤膜上滴加稀释液25ul，静置30秒后再滴加稀释液25ul，静置30秒，放置于色度定量分析仪上读取2、3、4、5、8、10、15、20分钟的色度值。
36.对照组：取上述制备的常规包被试剂条，向血细胞过滤膜上滴加配制的人肌红蛋白标记物混合液50ul，胶体金复溶液50ul，静置放置于色度定量分析仪上读取2、3、4、5、8、10、15、20分钟的色度值。
37.五、实验结果本发明胶体金标记物与试剂条为分离设立的组合状态，采用胶体金标记物与待检样本首先混合进行第一步反应，试剂条上不设置有常规的胶体金结合垫，位于试剂条上的硝酸纤维素膜作为检测反应的分散载体。实验结果见表1，常规方法检测15分钟后色度信号值基本稳定，本发明方法检测4分钟后色度信号值基本稳定，说明本发明方法检测可缩短检测时间，提高检测灵敏度。
38.表1、免疫胶体金法血液人肌红蛋白快速检测实验比较
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组别
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检测反应时间（分钟）/（色度值）
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10
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15
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20
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对照组
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12
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15
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23
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58
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91
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89实验组
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38
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78
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89
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93
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95
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。
39.实验二：乳胶微球免疫层析法肌钙蛋白i快速检测比较实验：一、本发明组合检测结构实验用材料：同“实验一”。
40.二、免疫检测标记物制备：采用常规免疫乳胶微球标记及双抗体夹心法检测方法，以乳胶微球标记抗人肌红蛋白第一单克隆抗体作为免疫检测标记物，以对人肌红蛋白具有与抗人肌红蛋白第一单克隆抗体配对的特异性免疫结合特性的抗人肌红蛋白第二单克隆抗体作为捕获剂，以非标记状态包被在硝酸纤维素膜上，通过免疫检测标记物结合人肌红蛋白，流经硝酸纤维素膜与捕获剂结合并捕获固定，通过测定乳胶微球标记物的捕获量，计算样本抗原浓度。具体操作，取2.0ml管，加入初洗液（10 mm mes ph 5.5，t20 0.05%）1ml，加入12.5微升度生物公司粒径300nm红色乳胶微球原液，混匀，10000rpm 离心20min；用初洗液配置50mg/ml的edc与nhs溶液，离心后去上清，加入750微升初洗液，超声溶解，加入100微升edc溶液与150微升nhs溶液，混匀，37℃活化15min后，10000rpm 离心20min; 离心后去上清，加入1ml偶联缓冲液（10 mm mesph 5.0，pc300 0.04%）超声混匀后10000rpm 离心20min; 离心后去上清，加入1ml偶联液超声混匀，加入50ug抗人心肌钙蛋白i第一单克隆抗体，37℃偶联2h后，超声2min后，10000rpm 离心20min; 离心后去上清，加入1ml封闭液超声混匀，37℃封闭30min，
10000rpm 离心20min; 离心后去上清，加入1ml终洗液超声混匀，10000rpm 离心20min; 离心后去上清，加入1ml 复溶液（复溶液为10mm tris ph8.5、0.4% 酪蛋白钠、0.02%吐温20、10%海藻糖的水溶液）超声混匀，4℃保存备用。
41.三、试剂条制备：常规对照组：在pvc支撑底片上依次粘贴乳胶微球结合垫、血细胞过滤膜、硝酸纤维素膜和吸水纸。将乳胶微球标记物包被在玻璃纤维素膜胶体金结合垫上，启动印膜仪，开启加压氮气，装载乳胶微球标记物溶液，开始喷膜包被，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 5.0μl／cm；将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥６小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。检测线t的捕获抗体为1.0mg/ml的非标记配对抗人肌红蛋白第二单克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜的中段；质控线c为1.0mg/ml的羊抗鼠igg多克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜的远端，用于捕获未被特异性捕获的乳胶微球标记抗人心肌肌钙蛋白i单克隆抗体。
42.本发明实验组：在pvc支撑底片上依次粘贴血细胞过滤膜、硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明实验组将乳胶微球标记物3.0μl／管分装至2ml保存管内，冻干，4℃保存使用。检测线t的捕获抗体为1.0mg/ml的非标记配对抗人心肌肌钙蛋白i第二单克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜的中段；质控线c为1.0mg/ml的羊抗鼠igg多克隆抗体，包被在硝酸纤维素膜的远端，用于捕获未被特异性捕获的胶体金标记抗人心肌肌钙蛋白i单克隆抗体。
43.试剂条制备：启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，置粘贴好的检测片于切条机上，切成 4.0mm试剂条。将试剂条放入有干燥剂的铝珀密封袋内，在封口机上封口，加贴标签备用。
44.四、实验方法：人心肌肌钙蛋白i溶液的配制：取已知浓度的人心肌肌钙蛋白i溶液，用样品稀释缓冲液（1%bsa，100mm 甘氨酸，50mm pbs, 150mm nacl，ph7.4）稀释配置5.0ng/ml的人心肌肌钙蛋白i溶液。
45.实验组：将上述配制的人心肌肌钙蛋白i溶液，以50ul/管加入上述制备的乳胶微球标记物管内，形成标记物混合液。取上述制备的本发明试剂条，向血细胞过滤膜上滴加配制的标记物混合液50ul，静置1分钟，再向血细胞过滤膜上滴加稀释液25ul，静置30秒后再滴加稀释液25ul，静置30秒，放置于色度定量分析仪上读取2、3、4、5、8、10、15、20分钟的色度值。
46.对照组：取上述制备的常规包被试剂条，向血细胞过滤膜上滴加配制的人心肌肌钙蛋白i液50ul与乳胶微球复溶液50ul的检测混合液，静置放置于色度定量分析仪上读取2、3、4、5、8、10、15、20分钟的色度值。
47.五、实验结果本发明乳胶微球标记物与试剂条为分离设立的组合状态，采用乳胶微球标记物与待检样本首先混合进行第一步反应，试剂条上不设置有常规的乳胶微球结合垫，位于试剂条上的硝酸纤维素膜作为检测反应的分散载体。实验结果见表2，常规方法检测15分钟后色度信号值基本稳定，本发明方法检测也4分钟后色度信号值出现稳定，说明本发明方法乳胶微球标记物检测也可缩短检测时间，提高检测灵敏度。
48.表2、本发明与常规乳胶微球标记实验的比较
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组别
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检测反应时间（分钟）/（色度值）
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10
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15
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20
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实验组
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15
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95
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113
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118
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117
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119
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120对照组
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36
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68
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109
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112
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。
49.实验三：荧光免疫层析法心型脂肪酸结合蛋白快速检测比较实验：一、本发明组合检测结构实验用材料：本实验荧光检测仪采用蓝勃afs-100干式荧光免疫分析仪，其它同“实验一”。
50.二、免疫检测标记物制备：采用“实验二”免疫检测标记物制备方法，以荧光微球作为指示剂，标记抗人心型脂肪酸结合蛋白第一单克隆抗体，以对人心型脂肪酸结合蛋白具有与第一单克隆抗体配对的特异性免疫结合特性的抗人心型脂肪酸结合蛋白第二单克隆抗体作为捕获剂，以非标记状态包被在硝酸纤维素膜上，通过免疫检测标记物结合人心型脂肪酸结合蛋白，流经硝酸纤维素膜与捕获剂结合并捕获固定，通过测定荧光微球标记物的捕获量，计算样本抗原浓度。具体采用度生物公司粒径300nm荧光微球，抗人心型脂肪酸结合蛋白第一单克隆抗体的加入量为30ug/ml，复溶液为10mm tris ph8.5、0.5% 酪蛋白钠、10%海藻糖的水溶液。
51.三、试剂条制备：常规对照组：以“实验二”常规对照组试剂条制备方法，采用荧光微球结合垫、荧光微球标记物、抗人心型脂肪酸结合蛋白第二单克隆抗体进行制备。硝酸纤维素膜包被抗体为1.2mg/ml的非标记配对抗人心型脂肪酸结合蛋白第二单克隆抗体。
52.本发明实验组：以“实验二”常规对照组试剂条制备方法，采用荧光微球标记物、抗人心型脂肪酸结合蛋白第二单克隆抗体进行制备，不用荧光微球结合垫，荧光微球标记物以3.0μl／管分装至2ml保存管内，冻干，4℃保存使用。硝酸纤维素膜包被抗体为1.2mg/ml的非标记配对抗人心型脂肪酸结合蛋白第二单克隆抗体。
53.试剂条制备：同“实验二”。
54.四、实验方法：人心型脂肪酸结合蛋白溶液的配制：取已知浓度的人心型脂肪酸结合蛋白溶液，用样品稀释缓冲液（1%bsa，100mm 甘氨酸，50mm pbs, 150mm nacl，ph7.4）稀释配置10.0ng/ml的人心型脂肪酸结合蛋白溶液。
55.实验组：将上述配制的人心型脂肪酸结合蛋白溶液，以50ul/管加入上述制备的荧光微球标记物管内，形成标记物混合液。取上述制备的本发明试剂条，向血细胞过滤膜上滴加配制的标记物混合液50ul，静置1分钟，再向血细胞过滤膜上滴加稀释液25ul，静置30秒后再滴加稀释液25ul，静置30秒，放置于荧光检测仪上读取2、3、4、5、8、10、15、20分钟的色度值。
56.对照组：取上述制备的常规包被试剂条，取配制的人心型脂肪酸结合蛋白液50ul，与50ul荧光微球复溶液混合，制成混合液，再将上述混合液向血细胞过滤膜上滴加100ul，静置放置于荧光检测仪上读取2、3、4、5、8、10、15、20分钟的色度值。
57.五、实验结果本发明荧光微球标记物与试剂条为分离设立的组合状态，采用荧光微球标记物与
待检样本首先混合进行第一步反应，试剂条上不设置有常规的荧光微球结合垫，位于试剂条上的硝酸纤维素膜作为检测反应的分散载体。实验结果见表3，常规方法检测15分钟后荧光信号值基本稳定，本发明方法检测也是4分钟后荧光信号值就基本稳定，说明本发明荧光微球标记物方法检测也可缩短检测时间，提高检测灵敏度。
58.表3、本发明与常规荧光微球标记实验的比较
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组别
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检测反应时间（分钟）/（发光值）
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10
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15
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20
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实验组
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189
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2972
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3862
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4022
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4103
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4121
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4098
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4172对照组
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102
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157
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2751693
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3506
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4027
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4321
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4433
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。
59.实验四：本发明生物素/亲和素系统的肌酸激酶同工酶（ckmb）快速检测的比较实验：一、本发明组合检测结构实验用材料：同“实验一”。
60.二、免疫检测标记物制备：采用常规免疫胶体金标记及双抗体夹心法检测方法，以胶体金微粒标记抗人肌酸激酶同工酶b单克隆抗体（au-ckbmab）作为免疫检测标记物，以生物素标记抗人肌酸激酶同工酶m单克隆抗体（bio-ckmmab）作为桥连接标记物，以非标记链亲和素包被在硝酸纤维素膜作为捕获剂，待检物ck-mb中的b亚型首先与免疫检测标记物au-ckbmab结合，形成au-ckbmab-ckmb，再与生物素标记物bio-ckmmab结合，形成au-ckbmab-ckmb-ckmmab-bio，流经硝酸纤维素膜与链亲和素（sv）结合，形成au-ckbmab-ckmb-ckmmab-bio-sv，并被捕获固定，通过测定胶体金标记物的捕获量，计算样本ckmb浓度。具体操作：胶体金标记物制备：取1.5ml离心管，加入粒径50nm胶体金溶液1ml，加入3.0ul 0.1m碳酸钾，搅拌均匀，加入抗人肌酸激酶同工酶b单克隆抗体10ug，反应10min后，加入20%bsa 10ul/ml，再反应10min后，用10000r/min 离心15分钟，去上清，沉淀用1ml胶体金复溶液（30mm tris、3%海藻糖、3%蔗糖、0.25% bsa）混悬，10000r/min 离心15分钟，去上清，沉淀再次用胶体金复溶液混悬，终体积为0.5ml，以2.0μl／管分装至2ml保存管内，冻干，4℃保存使用。另取一部分制备胶体金结合垫，将胶体金标记物包被在玻璃纤维素膜胶体金结合垫上，启动印膜仪，开启加压氮气，装载胶体金标记物溶液，开始喷膜包被，设定印膜条件为：喷笔移动速度30mm／秒，液体推进速度 5.0μl／cm；将印制后的膜放入干燥箱内，37℃干燥６小时，然后置于含干燥剂的密封袋内保存使用。
61.生物素标记物制备：取抗人肌酸激酶同工酶m单克隆抗体，用10 mm pbs ph7.4稀释到1.0mg/ml；取活化生物素（sigma），用ep管称量，用10 mm pbs ph7.4溶解，终浓度为20mm；按每2mg 抗人肌酸激酶同工酶m单克隆抗体加入20mm生物素 13.3ul，混匀，室温反应60min；反应结束后用10 mm pbs ph7.4透析，透析液200倍单抗体积，换液3次，透析完成后，以2.0μl／管分装至2ml保存管内，冻干，4℃保存使用。另取一部分制备生物素结合垫，将生物素标记物采用上述方法包被在玻璃纤维素膜生物素结合垫上，密封袋内保存使用。
62.三、包被固相膜制备：取链亲和素（sigma），用50mm 磷酸盐缓冲液ph7.4稀释制备浓度为100ug/ml的链
亲和素包被液。启动印膜仪，装载100ug/ml包被液，取贴有宽度20mm硝酸纤维素膜的pvc片，开始划线印膜，设定印膜条件为：喷笔移动速度10mm／秒，液体推进速度1.5μl/cm。将喷制好的膜放入37℃干燥箱内，干燥6小时，然后将膜置于含干燥剂的干燥容器内保存使用。
63.四、半成品组装：同“实验一”。常规对照组：在上述包被固相膜的硝酸纤维素膜近端依次粘贴血细胞过滤膜、胶体金结合垫和生物素结合垫，远端粘贴吸水纸垫。本发明实验组：在上述包被固相膜的硝酸纤维素膜近端粘贴血细胞过滤膜，远端粘贴吸水纸垫。启动除湿机使操作室内的湿度降低至25%以下，置粘贴好的检测片于切条机上，切成 4.0mm试剂条。将试剂条放入有干燥剂的铝箔密封袋内，在封口机上封口，加贴标签备用。
64.六、实验方法：人ckmb溶液的配制：取已知浓度的人ckmb溶液，用样品稀释缓冲液（1%bsa，100mm 甘氨酸，50mm pbs, 150mm nacl，ph7.4）稀释配置10.0ng/ml的人ckmb溶液。。
65.实验组：取胶体金标记物和生物素标记物进行混合（标记抗体量以标记物产率估算约7:3比例混合），制备标记物混合液管。将上述配制的人ckmb溶液，以50ul/管加入上述制备的标记物混合液管内，形成ckmb标记物混合液。
66.取上述制备的本发明实验试剂条，向血细胞过滤膜上滴加配制的ckmb标记物混合液50ul，静置1分钟，再向血细胞过滤膜上滴加稀释液25ul，静置30秒后再滴加稀释液25ul，静置30秒，放置于色度定量分析仪上读取2、3、4、5、8、10、15、20分钟的色度值。
67.对照组：取上述制备的常规包被试剂条，取配制的人ckmb溶液50ul，与50ul胶体金复溶液混合，制成混合液，将上述混合液向血细胞过滤膜上滴加100ul，静置放置于色度检测仪上读取2、3、4、5、8、10、15、20分钟的色度值。
68.六、实验结果本发明胶体金标记物与试剂条为分离设立的组合状态，采用生物素/亲和素检测系统，以链亲和素作为捕获剂检测人ckmb水平，结果见表4，常规方法检测15分钟后荧光信号值基本稳定，本发明方法检测4分钟后荧光信号值就基本稳定，说明本发明方法检测可缩短检测时间，提高检测灵敏度，同时适用于生物素/亲和素检测系统。
69.表4、免疫胶体金法ckmb快速检测实验比较
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结构种类
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检测反应时间（分钟）/（色度值）
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常规结构
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107本技术结构
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97
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102
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107
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112
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108
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110
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