肝微粒体体系中4-羟基双氯芬酸浓度的UPLC-MS/MS分析检测方法与流程

本发明涉及药物检测，具体而言涉及一种肝微粒体体系中4-羟基双氯芬酸浓度 的uplc-ms/ms分析检测方法。

背景技术：

1、cyp2c9代谢酶活性的改变，导致经代谢药物在体内的代谢速度增加或减慢，从而影响 药物在机体内的血药浓度的改变，反映出药物作用效果的强弱的改变甚至是否产生毒性。因 此，评价药物代谢过程中对cyp2c9代谢酶活性影响具有十分重要的意义。

2、目前研究主要的方向是提供体外方法研究药物代谢，研究代谢酶对底物的选择性代谢和 底物对酶的诱导和抑制，确定药物代谢途径，预测体内潜在的药物相互作用，从而可有效缩 短药物研发周期。

3、现有技术中，会采用探针药物法去评价cyp2c9代谢酶体外活性，先通过建立肝微粒体 温孵体系，建立药物代谢研究模型，在此模型的基础上，以双氯芬酸作为cyp2c9代谢酶的 特征性探针底物，通过高效液相色谱(hplc)、液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)，或者uplc-ms/ms法等方法测定其在肝微粒体中其主要代谢产物4-羟基双氯芬酸的含量变化，对cyp2c9代谢酶的活性进行评价。

4、但探针药物法采用同一个孵育体系，统一终止反应时间，不能很好地控制每个酶的反应 程度，很容易出现反应过量的现象，从而导致不能得到最佳的代谢产物，影响测试的准确性， 以及影响后续的测试；且目前的检测也存在进样量大、分析方法时间长、线性范围窄等缺点， 不能满足生物分析检测的需求。

5、例如，公开号为cn105241992a的中国专利文献公开了一种肝微粒体中4’-羟基双氯芬 酸浓度的uplc-ms/ms检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物 和系列浓度的4’-羟基双氯芬酸对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入uplc/ms/ms液质联用仪进行检测；根据检测结果得到4’-羟基双氯芬酸的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法制备待测样品，将待测样品注入uplc/ms/ms液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的4’-羟基双氯芬酸浓度。该发明虽 然在一定程度上缩短了分析时间，提高了灵敏度，但其精度和时间仍然存在缺陷，有待进一 步提高。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种肝微粒体4-羟基双氯芬酸浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，该检测方法灵敏度高，稳定精确，且提高了分析效率。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种肝微粒体体系中4-羟基双氯芬酸浓度的uplc-ms/ms分析检测方法，包括以下具体 步骤：

4、s1、建立肝微粒体温孵体系

5、在pbs缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、氯化镁溶液，以及底物进行预孵育，之后加 入还原型辅酶ⅱ启动反应，在恒温水浴锅中温孵；

6、s2、标准曲线样品及待测样品的配制

7、根据步骤s1中建立的肝微粒体温孵体系，将系列浓度的4-羟基双氯芬酸、混合的人肝微 粒体、氯化镁溶液以及还原型辅酶ⅱ混合，配制系列浓度的标准曲线样品溶液；

8、按照步骤s1中的建立肝微粒体温孵体系，在pbs缓冲溶液中加入混合的人肝微粒体、 氯化镁溶液，以及10μm的双氯芬酸底物进行预孵育，之后加入还原型辅酶ⅱ启动反应，在恒 温水浴锅中进行温孵，温孵结束后得到待测样品溶液；

9、s3、样品进样前处理

10、在步骤s2得到的标准曲线样品溶液和待测样品溶液中加入内标工作溶液终止反应，涡 旋、振荡、离心，取离心后的上清液至孔板中，每孔中加入超纯水溶液复溶，封膜、摇板；

11、s4、uplc-ms/ms分析检测

12、将步骤s3处理后的样品进行uplc-ms/ms分析检测，其中，

13、色谱检测条件：

14、流动相a：0.1％甲酸水溶液；流动相b：0.1％甲酸乙腈溶液；

15、洗针液：异丙醇/甲醇/乙腈/超纯水混合液，体积比为1:3:3:3；

16、色谱柱：acquity uplc hss t3；

17、流速：0.5ml/min；

18、保留时间：4-羟基双氯芬酸：1.34min；tolbutamide：1.33min；

19、洗脱时间：2.5min；

20、色谱洗脱程序为：0～0.30min流动相b的体积百分数为20％，0.30～1.00min流动相b的 体积百分数为20％升至90％，1.00～2.10min流动相b的体积百分数为90％，2.10～2.11min流 动相b的体积百分数为90％降至20％，2.11～2.50min流动相b的体积百分数为20％；

21、质谱条件为：

22、质谱离子源：esi电喷雾电离源；极性：正离子模式；扫描类型：mrm多反应离子监测； 碰撞气：medium；气帘气：35psi；分辨率q1/q3：unit/unit；喷雾气：50psi；辅助加热气：50psi；喷雾电压：5500v；离子化温度：550℃；采集时长：2.50min；

23、根据检测结果得到4-羟基双氯芬酸的标准曲线，并根据标准曲线得到待测样品中的4-羟 基双氯芬酸浓度。

24、优选地，所述步骤s1中，人肝微粒体的孵育浓度为0.2mg/ml，氯化镁溶液的孵育浓度 为10mm，还原型辅酶ⅱ的孵育浓度为1mm；预孵育时间为5min，启动反应后，在37℃恒 温水浴锅中的孵育时间为25min。

25、优选地，所述步骤s2中，标准曲线样品浓度范围为0.01μm～10μm。

26、优选地，所述步骤s3中，内标工作溶液为100ng/ml的甲苯磺丁脲；上清液和超纯水的 体积比为1:4；

27、前处理的条件如下：以2500rpm的转速涡旋振荡5min；在4℃的条件下，以12000rpm的转速离心5min；以300rpm的转速摇板5min。

28、优选地，所述步骤s4中，色谱柱的规格为：长50mm×内径2.1μm，填充颗粒1.8μm。

29、优选地，所述步骤s4中，uplc检测条件中流速为0.5ml/min。

30、优选地，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样量为5μl。

31、优选地，所述步骤s4中，uplc检测条件中进样时间为2.50min。

32、优选地，所述步骤s4中，uplc检测条件中，柱温为40℃，自动进样器的温度为4℃。

33、优选地，所述步骤s4中，离子监测采集参数如下：

34、4-羟基双氯芬酸：母离子为312.053da；子离子为230.000da；驻留时间为60.0ms；入口 电压为150.000volts；去簇电压为10.000volts；碰撞电压为37.000volts；碰撞池入口电压为 12volts；

35、甲苯磺丁脲：母离子为271.151da；子离子为91.100da；驻留时间为60.0ms；入口电压 为21.000volts；去簇电压为10.000volts；碰撞电压为43.000volts；碰撞池入口电压为8.000volts。

36、由以上本发明的技术方案可见，本发明提出的肝微粒体体系中4-羟基双氯芬酸浓度的 uplc-ms/ms分析检测方法，在检测肝微粒体体系中4-羟基双氯芬酸浓度时，通过建立包含 人肝微粒体、还原型辅酶ⅱ、氯化镁溶液和pbs缓冲液在内的合理的肝微粒体孵育体系，找 到代谢物浓度最高的肝微粒体孵育体系，并通过不断优化质谱检测参数，使质谱响应达到最 优化的水平，结合优化不同色谱柱型号、柱温箱温度、流动相a和流动相b的比例，不同梯 度及等度方法等色谱检测条件，达到降低检测限及扩大检测线性范围的效果。4-羟基双氯芬 酸的最低检测限可达0.01μm，检测线性范围为0.01μm～10μm，提高分析检测的灵敏度。

37、本发明通过将复杂的液液提取法优化为直接蛋白沉淀法，缩短样品前处理时间及步骤， 并结合优化色谱质谱参数后，缩短生物样品检测时间，极大缩短了生物样品分析检测时间， 提高了检测效率。建立的生物分析检测方法快速、专属、精确、可靠且线性范围广，符合2020 版《中华人民共和国药典》生物样品定量分析方法验证指导原则要求，适用于肝微粒体温孵 样品中4-羟基双氯芬酸浓度的测定，具有广泛的应用前景。