一种有机磷酸二酯和三酯的协同测定方法与应用

本发明属于有机污染物分析检测，特别涉及一种有机磷酸二酯和三酯的协同测定方法与应用。

背景技术：

1、有机磷酸三酯(tri-opes)作为阻燃剂、增塑剂和其他添加剂被广泛应用于各种家用和工业产品，例如纺织品、塑料、电子产品、家具、婴儿用品等。tri-opes通常以物理方式而非化学键合的形式添加于各类产品中，在消费品生产、运输和使用过程中容易通过挥发、浸泡溶出或磨损等方式释放到土、水、气等各类环境介质中。tri-opes对生物体具备一定的神经毒性、致癌性、生殖和发育毒性。

2、tri-opes可通过水解、生物降解、动物代谢等途径转化成有机磷酸二酯(di-opes)。其中，磷酸二正丁酯(dnbp)、双(丁氧基乙基)磷酸酯(bboep)、磷酸二苯酯(dphp)和双(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯(bdcipp)为主要代谢产物，其亲水性比tri-opes更强，且部分di-opes毒性比母体化合物更高。

3、目前tri-opes和di-opes分析检测流程多采用独立的萃取、净化、检测流程。样品前处理，固体样品中tri-opes和di-opes提取方法包括索式抽提、加速溶剂萃取、微波辅助萃取等；而样品净化过程则通常采用凝胶渗透色谱柱、复合硅胶柱、亲水亲脂聚合物固相萃取柱(hlb柱)、弱阴离子交换固相萃取柱(pwax柱)等；这些方法一方面耗费大量溶剂、填料，时间及费用成本高；另一方面流程复杂，操作不便。因而，建立一种快捷、简便、萃取效率高、净化效果好的有机磷酸二酯和三酯协同检测方法是亟待解决的问题之一。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有机磷酸二酯和三酯的协同测定方法。

2、本发明的另一目的在于提供上述植物中有机磷酸二酯和三酯协同测定方法的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种有机磷酸二酯和三酯的协同测定方法，包括以下步骤：

5、(1)将样品干燥并均质化；

6、(2)取均质化后的样品，进行第一次萃取，得到试样a；

7、(3)在步骤(2)中萃取后剩余的样品中加入试剂进行第二次萃取，得到试样b；

8、(4)对试样a和b分别进行浓缩、净化；

9、(5)分别检测浓缩后的试样a中的有机磷酸三酯和浓缩后的试样b中的有机磷酸二酯。

10、步骤(1)所述的干燥为冷冻干燥；优选为在-47℃，真空度0.5mpa的条件下冷冻干燥。

11、步骤(1)所述的均质化为使用研磨机将样品研磨成粉末。

12、优选地，步骤(1)中还加入了回收率指示剂；更优选为分别使用d18-dnbp、d10-bdcpp和d8-bboep各100ng作为di-opes回收率指示剂；使用d12-tcep和d15-tphp各100ng作为tri-opes回收率指示剂。

13、上述回收率指示剂完全溶于样品中，且不会与样品中的di-opes和tri-opes发生化学反应，峰位与待测组分接近且能完全分开，能准确评估方法流程是否满足质控需求。

14、步骤(2)所述的第一次萃取为使用正已烷/二氯甲烷混合溶剂进行萃取；优选为使用正已烷与二氯甲烷体积比为1～2:1～2的混合溶剂进行萃取；进一步优选为使用正已烷与二氯甲烷体积比为1:1的混合溶剂进行萃取。

15、步骤(2)所述的第一次萃取的具体步骤为：

16、加入溶剂后振荡，超声后分离萃取液，合并萃取液得到试样a；优选为加入溶剂后涡旋振荡1min，在100hz下超声10min，3000rpm离心5min，分离萃取液，此过程重复3次，所加溶剂量依次为10、5和5ml，合并萃取液得到试样a。

17、步骤(3)所述的第二次萃取为使用乙酸/乙腈混合溶剂进行萃取；优选为使用乙酸与乙腈体积比为1～3:23的混合溶剂进行萃取；进一步优选为使用乙酸与乙腈体积比为2:23的混合溶剂进行萃取。

18、步骤(3)所述的第二次萃取的具体步骤为：

19、加入溶剂后振荡，超声后分离萃取液，合并萃取液得到试样b；优选为加入溶剂后涡旋振荡1min，在100hz下超声10min，3000rpm离心5min，分离萃取液，此过程重复3次，所加溶剂量依次为10、5和5ml，合并萃取液得到试样b。

20、步骤(4)所述的浓缩为使用氮气气流浓缩。

21、优选地，步骤(4)所述的试样a的浓缩的具体步骤为：

22、使用氮气浓缩至0.5ml，加入1ml异丙醇，再次浓缩至0.5ml后加入3ml含有8％乙酸的乙腈。

23、步骤(4)所述的净化为使用石墨化碳黑填料净化；优选为使用120～400目的石墨化碳黑填料。

24、优选地，步骤(4)所述的净化的具体步骤为：

25、加入0.2g石墨化碳黑填料，涡旋1min后在3000rpm下离心5min，分离上清液，再次加入3ml含有8％乙酸的乙腈并重复上述步骤，将两次分离得到的上清液合并，浓缩至0.5ml，并用1ml甲醇置换两次，然后用0.22μm尼龙过滤器进行过滤。

26、优选地，步骤(4)中还加入了内标试剂；更优选为加入100ng内标(di-opes为d8-bcep和d10-dphp；tri-opes为d15-tep、d18-tcipp和d27-tnbp)，在3000rpm下涡旋混合均匀。

27、步骤(5)所述的检测为使用高效液相色谱质谱联用仪进行检测；优选为使用thermo scientific vanquish高效液相色谱仪串联tsq quantis三重四极杆质谱进行检测。

28、上述的高效液相色谱质谱联用仪的参数优选为：

29、分析样品di-opes采用thermo scientific vanquish高效液相色谱仪串联tsqquantis三重四极杆质谱(hplc-ms/ms)。色谱柱型号为acclaim 120c18柱(100×2.1mm,2.2μm；thermo scientific,bellefonte,pa,usa)，柱温箱温度为40℃，进样体积为1μl，自动进样器温度为4℃。流动相a和流动相b分别为含0.2％甲酸的超纯水和含0.2％甲酸的甲醇。使用选择反应监测(srm)模式检测和量化di-opes。质谱参数设置如下：离子喷雾(esi)电压分别为-3500v和+3500v，鞘气和辅助气压力分别为35和15arb。离子传输管温度设置为320℃，离子源温度为350℃。数据采集和峰值采集使用xcalibur软件。di-opes液相梯度洗脱程序为：

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32、分析样品tri-opes采用thermo scientific vanquish高效液相色谱仪串联tsqquantis三重四极杆质谱。色谱柱型号为acclaim 120c18柱(100×2.1mm,2.2μm；thermoscientific,bellefonte,pa,usa)，柱温箱温度为40℃，进样体积为1μl，自动进样器温度为4℃。流动相a为含0.2％甲酸的超纯水，流动相b为含0.2％甲酸的甲醇。使用选择反应监测(srm)模式检测和量化tri-opes。质谱参数设置如下：esi电压为+3500v，鞘气和辅助气压力分别为8和1arb。离子传输管温度为320℃，离子源温度为350℃。数据采集和峰值采集使用xcalibur软件。tri-opes液相梯度洗脱程序为：

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34、上述使用高效液相色谱质谱联用仪测定样品中的di-opes和tri-opes，根据离子对信息和保留时间定性，采用多点内标法校正标准曲线定量分析。十四种di-opes和十七种tri-opes化合物的log kow、离子对信息及保留时间如下(其中ss为回收率指示剂，is为内标)：

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37、di-opes和tri-opes的检测分析中标准曲线的线性方程、相关系数(r2)和线性范围如下表所示：

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40、所述有机磷酸二酯和三酯的协同测定方法在有机污染物分析检测技术领域中的应用。

41、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

42、本发明通过向预处理后的样品添加回收率指示剂，根据有机磷酸二酯和三酯的性质采用分步超声萃取；萃取液离心分离浓缩，利用石墨化碳黑进行净化；最后使用高效液相色谱质谱联用仪测定样品中的有机磷酸二酯和三酯。本发明采用分步萃取，同步净化的方法，对样品中物化性质差异大的di-opes和tri-opes进行提取净化。与目前已有的方法相比，此方法的优点包括样品用量少、前处理时间短、样品净化效果好、目标物回收率高、且结果重现性高。所采用的hplc-ms/ms对di-opes和tri-opes分析定量，对化合物分离效果好，响应高，可以提高化合物检测的准确性。