一种山羊痘病毒抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及生物技术和动物疫病诊断，具体涉及一种山羊痘病毒抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

1、山羊痘是由山羊痘病毒（goatpox virus，gtpv）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，感染后可引起病羊皮肤、消化道粘膜和呼吸道出现痘疹等症状，是最为严重的一种动物痘病。该病属于国家一类动物疫病，危害性很大，羊群的感染率和病死率均很高，感染羔羊的死亡率可达100%。山羊痘病毒在世界范围内均有分布，其传播速度快，发病率和死亡率均较高，给养羊业带来严重损失。山羊痘活疫苗的使用，有效地控制了山羊痘的流行；牛结节性皮肤病病毒与羊痘病毒同属于痘病毒科、羊痘病毒属，在牛结节皮肤病的防控过程中，山羊痘活疫苗也起到至关重要的作用。但是，由于免疫的不确定性，导致部分地区还有山羊痘的零星发生。

2、目前，对山羊痘的诊断主要依据临床症状和剖检病变，以及免疫学方法、分子生物学方法。常用的病毒中和试验方法存在周期长、特异性和敏感性不强等的缺点；中国发明专利申请cn102313803a公开一种山羊痘正向间接血凝诊断试剂及其制备方法和检测方法，检测用时需要50分钟；中国兽医学报发表的学术论文《山羊痘病毒p32基因的截短表达及间接elisa方法的建立和应用》公开一种羊痘病毒抗体间接elisa方法，检测用时较长，且仅能用于羊源血清样本中羊痘病毒抗体检测。

3、荧光纳米材料凭借高灵敏度和良好的选择性而具有很好的应用前景，在各种荧光标记物中，荧光微球是ica中最有前景的。荧光微球免疫分析结合了荧光与免疫分析技术的优势，将微弱、复杂的抗原抗体反应信号放大到易检测的光学信号，有效地排除非特异荧光的干扰，可实现高灵敏度、宽线性范围、试剂的稳定性良好、操作简单、检测效率高，产品便于储存，现已广泛应用到生物学的各个领域，未来的发展空间将更为广阔。

4、本发明利用荧光微球作为标记材料，研制出一种适用于现场检测、操作简单、快速、高灵敏的检测山羊痘病毒抗体的荧光微球快速检测试剂盒，实现了山羊痘病毒抗体快速检测，可以用于辅助山羊痘活疫苗更好地防控羊痘病毒病及牛结节性皮肤病的发生。

技术实现思路

1、针对现有山羊痘抗体检测时间长的技术问题，本发明提供一种山羊痘病毒抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒具有快速、灵敏、准确、稳定等优点，适用于临床大规模样本的检测。

2、第一方面，本发明提供一种山羊痘病毒抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒，至少包括试纸条，试纸条自加样端开始依次为样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；结合垫上喷涂有山羊痘截短蛋白标记羧基修饰的时间分辨荧光微球，山羊痘截短蛋白的核苷酸序列如seq id no：1所示，山羊痘截短蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示；硝酸纤维素膜上设置有检测线（t线）和质控线（c线），靠近加样端的检测线包被有山羊痘截短蛋白；靠近吸水垫端的质控线包被有鼠原山羊痘截短蛋白的单克隆抗体。

3、进一步的，时间分辨荧光微球为平均粒径为200nm的聚苯乙烯-羧基荧光微球。

4、进一步的，检测线包被的山羊痘截短蛋白终浓度为0.2mg/ml，质控线包被的鼠原单克隆抗体终浓度为0.5mg/ml；检测线与质控线喷膜液量都为0.5μl/cm。

5、进一步的，还包括样品稀释液，样品稀释液为ph=8.5的0.01m tris缓冲液，内含2%蔗糖、10%牛血清白蛋白、0.1%叠氮钠。

6、优选的，所述吸水垫为吸水纸。

7、进一步的，还包括外壳底座和外壳上盖，试纸条按照对应方向放置于外壳底座中，外壳底座与外壳上盖通过卡扣连接。

8、第二方面，本发明提供一种山羊痘病毒抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒的制备方法，至少包括如下步骤：

9、s1结合垫的制备

10、（1）荧光微球的制备：将纯化的山羊痘病毒截短蛋白偶联到羧基修饰的时间分辨荧光微球上；

11、（2）结合垫处理：将山羊痘截短蛋白标记羧基修饰的时间分辨荧光微球用悬浮保存液悬浮，均匀喷到结合垫上，37℃烘干，备用；

12、悬浮保存液为ph=8.0的0.05m硼酸缓冲液，内含1%牛血清白蛋白、0.1%sds、0.1%叠氮钠；

13、s2硝酸纤维素膜上检测线和质控线的包被

14、（1）用检测线包被缓冲液将山羊痘截短蛋白配制成终浓度0.2mg/ml，检测线包被缓冲液为ph=7.0的0.01m tris缓冲液，内含1%牛血清白蛋白、0.1%叠氮钠；

15、用质控线包被缓冲液将鼠原单克隆抗体配制成终浓度0.5mg/ml，质控线包被缓冲液为ph=7.0的0.01m pbs缓冲液，内含1%牛血清白蛋白、0.1%叠氮钠；

16、（2）按照0.5μl/cm的喷膜液量，依次将检测线和质控线划线到硝酸纤维素膜上。

17、进一步的，纯化的山羊痘病毒截短蛋白按照如下方法获得：

18、（a）设计引物序列如下：

19、上游引物：5'-gggaattccatatggcagatatcccatt-3'（seq id no：3）；

20、下游引物：5'-cgccgctcgagttcaattataatgttata-3'（seq id no：4）；

21、（b）通过pcr扩增截短基因4-420bp，双酶切pcr和pet28a（+）质粒，回收后的基因片段克隆到pet28a（+）质粒上获得重组表达载体，测序正确；

22、（c）重组质粒转化 e. coli bl21（de3）感受态细胞，诱导表达，然后使用镍离子亲和层析法纯化目的蛋白。

23、进一步的，鼠原单克隆抗体按照如下方法获得：

24、（i）免疫：将纯化的截短蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1：1的比例混合，对6-8周龄balb/c小鼠进行免疫，皮下注射，每隔2周免疫一次；

25、（ii）细胞融合：将balb/c小鼠体内的脾细胞与骨髓瘤细胞按细胞数量10：1的比例混合，按照常规方法进行融合；

26、（iii）杂交瘤筛选及克隆：待细胞长至孔底的1/3时，采用间接elisa方法测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，直到亚克隆至100%阳性为止；

27、（iv）抗体制备及纯化：采用小鼠体内腹水诱生法收集腹水，然后用硫酸铵两步沉淀法提取纯化腹水中的igg蛋白，再用spa柱法对腹水进一步纯化，即得。

28、进一步的，还包括s3试纸条的组装，将试纸条切割为4mm宽后装入外壳底座中，压紧外壳上盖，装入铝箔袋中，并加入干燥剂密封保存。

29、第三方面，本发明还提供一种山羊痘病毒抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒的使用方法，具体为用样品稀释液对血清样本进行100倍稀释，取80μl滴入加样孔中，10-15min后用干式免疫荧光分析仪读取试纸条上的t/c值，进行结果判定。

30、本发明采用双抗原夹心法，检测卡的结合垫中含有时间分辨荧光微球标记的山羊痘病毒截短蛋白，在硝酸纤维素膜检测线喷涂山羊痘病毒截短蛋白，质控线喷涂鼠源山羊痘病毒截短蛋白的特异性单克隆抗体。当进行检测时，若血清样本中存在山羊痘病毒抗体，抗体的fab片段先被结合垫中的时间分辨荧光微球标记的山羊痘病毒截短蛋白特异性结合，而免疫复合物通过侧向层析的方式流动至硝酸纤维素膜的检测线区域，抗体的另一个fab片段与检测线上山羊痘病毒截短蛋白结合，完成检测信号。未反应的荧光微球标记山羊痘病毒截短蛋白流动至质控线，与鼠抗山羊痘病毒截短蛋白单克隆抗体结合。本发明实现了从血清中对山羊痘病毒抗体进行检测，具有操作便捷、检测灵敏、可靠稳定等优点。

31、与现有技术相比，本发明具有以下特点：

32、（1）本发明运用双抗原夹心原理，以特异性单抗做质控线，同时结合时间分辨荧光微球技术，与传统的胶体金相比，大大提高了检测卡的灵敏度与稳定性。

33、（2）现有免疫检测技术多用elisa方法，本发明无需特殊的设备和专业的技术人员，可使用商品化的干式免疫荧光分析仪或普通的紫外灯判读结果，操作简便。

34、（3）本发明所述的试剂盒能快速、灵敏、准确的检测牛、羊血清中gtpv抗体水平，填补了国内外该领域的空白，用以代替病毒中和试验等传统的血清学方法，适用于以实现敏感性高、特异性强、稳定性好的高通量大规模的gtpv抗体的检测。