手性碳量子点的应用

1.本发明涉及手性碳量子点的新用途，特别涉及手性碳量子点在作为真菌/细菌成像材料的应用。


背景技术：

2.碳量子点(carbon quantum dots，cqds)，也称碳点(carbon dots，cds)或碳纳米点，是一类以碳为骨架结构、有良好分散性、粒径小于10nm的球形荧光纳米颗粒，是继富勒烯、碳纳米管、石墨烯之后发现的一种新型的零维碳基纳米材料。由于具有纳米尺寸效应、可调节的光致发光性质、低毒性、良好的生物相容性、表面易修饰等特点，碳量子点在生物检测、荧光成像、催化、抗肿瘤等领域被广泛研究及应用。
3.另一方面，细菌感染是全球面临的最大挑战之一，细菌感染的快速诊断对于临床治疗具有至关重要作用。鉴别未知细菌的标准方法是革兰氏染色法，它将细菌种类分为两类：革兰氏阳性和革兰氏阴性。但是这种方法有一些缺点，例如繁琐的程序和容易产生假阳性结果。定量实时pcr(qpcr)已被认为是一种高度敏感的细菌物种鉴定技术，但这种技术对于发展中国家的许多地方来说过于昂贵，这极大地限制了它的实际应用。因此，发明快速的细菌感染诊断和简便、高效的细菌识别技术非常迫切。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种手性碳量子点的新用途。
5.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种区分革兰氏阳性菌/真菌与革兰氏阴性菌的区分方法。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种手性碳量子点作为细菌和/或真菌成像材料的应用。
7.具体的，发明人通过大量研究发现手性碳量子点(左旋手性碳量子点或右旋手性碳量子点)均具有良好的手性性质，荧光性能稳定且具有激光波长依赖的荧光发射特点。此外，手性碳量子点的毒性低、生物相容性好、抗光漂白。因此，在细菌和/或真菌的成像材料方面具有良好的应用前景。
8.具体的，在本发明的一个实施例之中，手性碳量子点的制备方法为：将氢氧化钠、左旋半胱氨酸或右旋半胱氨酸、水按照(0.1～1)：(3～7)：(120～200)的重量比混合，在100～140℃反应12～20h，所得反应液经离心、透析后得到手性碳量子点。
9.其中，以左旋半胱氨酸或右旋半胱氨酸作为手性源和碳源，以氢氧化钠作为碳化聚合反应的催化剂，以水为分散剂，组成反应体系后进行水热反应。水热反应后离心，得到的上清液采用孔径为0.2～0.3μm的圆柱形过滤膜过滤，然后采用截留分子量为500～1000da的透析带透析12～36h(以水为透析外液，每隔4h更换一次透析外液)，得到手性碳量子点水溶液，然后在-100℃～-50℃真空冷冻干燥24～48h，得到手性碳量子点成品。
10.基于上述方法制备得到的手性碳量子点，其分散均匀，平均粒径为4～5.5nm。更具
体的，左旋手性碳量子点(l-cds)的平均粒径为5～5.5nm，晶格间距为0.2～0.25nm；右旋手性碳量子点(d-cds)的平均粒径为4～5nm，晶格间距为0.3～0.35nm，两者均具有良好的晶体结构。进一步的，基于上述方法制备得到的手性碳量子点，荧光性能稳定，这为其作为细菌和/或真菌的成像材料奠定了良好的基础。
11.需要说明的是，传统的半导体量子点毒性大、光稳定性差，难以应用为细菌和/或真菌的成像材料。此外，手性氨基酸功能化修饰的石墨烯量子点能选择性杀死细菌而对哺乳动物细胞无毒，能在3h内对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及hela细胞进行生物成像。但这种碳量子点不能在短时间(30min)内有效地区分革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌，更无法区分革兰氏阴性菌与真菌，故不能很好的作为革兰氏阳性菌/真菌的成像材料。
12.而本发明的手性碳量子点与细菌/真菌孵育约30min后，可对革兰氏阳性菌与真菌进行很好的染色，而不对革兰氏阴性菌进行荧光成像，从而达到将革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌/真菌区分的目的。此外，本发明的手性碳量子点可实现蓝、绿、红色三色荧光成像。
13.进一步的，在本发明的一个实施例之中，所述的细菌为革兰氏阳性菌。具体的，发明人经过大量的试验发现，本发明中的手性碳量子点可实现革兰氏阳性菌的良好染色，使得其在三种激光激发下显示蓝、绿、红色三色荧光，进而达到鉴别其的目的。优选的，革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌(s.aureus,atcc25923)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa,atcc43300)、粪肠球菌(e.faecalis,atcc29212)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis,cmcc(b)63501)。
14.进一步的，在本发明的一个实施例之中，所述真菌为白色念珠菌(c.albicans,atcc10231)、近平滑白色假丝酵母(c.parapsilosis,atcc22019)，但不限于此。
15.相应的，本发明还公开了一种区分革兰氏阳性菌/真菌与革兰氏阴性菌的方法，其包括将待检测菌与手性碳量子点共同孵育，然后进行检测的步骤。
16.其中，手性碳量子点可为左旋手性碳量子点(l-cds)或右旋手性碳量子点(d-cds)。
17.其中，共同孵育时间≥30min，若孵育时间＜30min，则在革兰氏阳性菌/真菌中观察到的荧光较为微弱。优选的，孵育时间为30～40min，通过该孵育时间，荧光明显，检测准确性高，且检测效率高。
18.其中，检测采用流式细胞仪检测或激光共聚焦(clsm)显微镜检测，但不限于此。优选的，采用激光共聚焦(clsm)显微镜检测；其检测波长分别为405nm、488nm和552nm。进一步的，当采用激光共聚焦(clsm)显微镜检测时，若待测菌在405nm、488nm、552nm三种激发波长的激发下显示出蓝、绿、红色荧光，则待测菌为革兰氏阳性菌或真菌；否则待测菌为革兰氏阴性菌。
19.优选的，在本发明的一个实施例之中，所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌、奇异变形杆菌和/或沙门氏菌；所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和/或枯草芽孢杆菌。
20.优选的，在本发明的一个实施例之中，所述真菌为白色念珠菌和/或近平滑白色假丝酵母；
21.所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌、奇异变形杆菌和/或沙门氏菌。
22.实施本发明具有如下有益效果：
23.本发明提供一种手性量子点作为细菌和/或真菌的成像材料的应用。具体的，本发明的手性碳量子点(左旋手性碳量子点或右旋手性碳量子点)具有毒性低、生物相容性好、抗光漂白、荧光性能稳定的优点，且其具备手性性质，具有激光波长依赖的荧光发射，适宜作为细菌和/或真菌的成像材料。采用本发明的手性量子点作为成像材料，可达到对革兰氏阳性细菌与真菌的检测，以及对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的区分。
附图说明
24.图1为实施例1、实施例2中手性碳量子点的结构表征及光物理性能图；其中，a为手性碳量子点(d-cds、l-cds)的圆二色光谱图；b为手性碳量子点(d-cds、l-cds)的zeta电位图；c为右旋手性碳量子点(d-cds)的透射电镜形貌图和粒径分布图；d为右旋手性碳量子点(d-cds)的高分辨透射电镜及晶格形貌图；e为右旋手性碳量子点(d-cds)的荧光光谱图；f为不同比例四氢呋喃-水混合物中右旋手性碳量子点(d-cds)荧光光谱图；g为不同比例四氢呋喃-水混合物中右旋手性碳量子点(d-cds)荧光强度变化的折线图；h为60％(v:v)四氢呋喃-水混合物中右旋手性碳量子点(d-cds)的透射电镜形貌图；
25.图2为实施例1、实施例2中手性碳量子点的结构表征及光物理性能图；其中，a为手性碳量子点(d-cds、l-cds)的紫外-可见吸收光谱图；b为手性碳量子点(d-cds、l-cds)的傅里叶变换红外光谱图；c为左旋手性碳量子点(l-cds)的透射电镜形貌图和粒径分布图；d为左旋手性碳量子点(l-cds)的高分辨透射电镜和晶格形貌图；e为左旋手性碳量子点(l-cds)的荧光光谱图；f为不同比例四氢呋喃-水混合物中左旋手性碳量子点(l-cds)的荧光光谱图；g为不同比例四氢呋喃-水混合物中左旋手性碳量子点(l-cds)荧光强度变化的折线图；h为70％(v:v)四氢呋喃-水混合物中左旋手性碳量子点(l-cds)的透射电镜形貌图；
26.图3为手性碳量子点与革兰氏阳性菌的激光共聚焦(clsm)显微镜图像及流式细胞仪检测结果图；其中，a为右旋手性碳量子点(d-cds)，b为左旋手性碳量子点(l-cds)；
27.图4为手性碳量子点与革兰氏阴性菌的激光共聚焦(clsm)显微镜图像及流式细胞仪检测结果图；其中，a为右旋手性碳量子点(d-cds)，b为左旋手性碳量子点(l-cds)；
28.图5为手性碳量子点与真菌的激光共聚焦(clsm)显微镜图像及流式细胞仪检测结果图；其中，a为右旋手性碳量子点(d-cds)，b为左旋手性碳量子点(l-cds)。
具体实施方式
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
30.实施例1左旋手性碳量子点(l-cds)的制备与表征
31.本实施例提供一种左旋手性碳量子点的制备方法，具体如下：
32.(1)精密称量0.06g氢氧化钠于15ml超纯水中，玻璃棒搅拌溶解，加入0.5g左旋半胱氨酸，搅拌溶解并进行超声处理10min直至样品充分混匀；
33.(2)将分散后的溶液转移至50ml聚四氟乙烯内衬中，并装入高压反应釜钢套中；
34.(3)将反应釜置于电热鼓风干燥箱中，于120℃水热反应16h；
35.(4)反应结束后待反应釜冷却至室温，将所得橙红色悬浊液经10000rpm离心10min收集上清液；
36.(5)将上清液用0.22μm圆柱形过滤膜过滤处理，并将所得滤液转移至mw＝1000da透析袋内，置于去离子水中透析24h，期间每4h更换一次透析外液；
37.(6)透析过程结束后，收集透析袋内的黄色溶液，得到纯净的左旋手性碳量子点水溶液；
38.(7)将黄色的碳量子点溶液经真空冷冻干燥机在-60℃冷冻干燥48h，所得到棕色粉末，即为左旋手性碳量子点，于4℃保存备用。
39.实施例2右旋手性碳量子点(d-cds)的制备与表征
40.本实施例提供一种右旋手性碳量子点的制备方法，具体如下：
41.(1)精密称量0.06g氢氧化钠于15ml超纯水中，玻璃棒搅拌溶解，加入0.5g右旋半胱氨酸，搅拌溶解并进行超声处理10min直至样品充分混匀；
42.(2)将分散后的溶液转移至50ml聚四氟乙烯内衬中，并装入高压反应釜钢套中；
43.(3)将反应釜置于电热鼓风干燥箱中，于120℃水热反应16h；
44.(4)反应结束后待反应釜冷却至室温，将所得橙红色悬浊液经10000rpm离心10min收集上清液；
45.(5)将上清液用0.22μm圆柱形过滤膜过滤处理，并将所得滤液转移至mw＝1000da透析袋内，置于去离子水中透析24h，期间每4h更换一次透析外液；
46.(6)透析过程结束后，收集透析袋内的黄色溶液，得到纯净的右旋手性碳量子点水溶液；
47.(7)将黄色的碳量子点溶液经真空冷冻干燥机在-60℃冷冻干燥48h，所得到棕色粉末，即为右旋手性碳量子点，于4℃保存备用。
48.将实施例1、2得到的左旋碳量子点(l-cds)、右旋碳量子点(d-cds)进行测试，具体测试方法如下：
49.1)移液枪吸取2ml浓度0.01mg/ml的手性碳量子点溶液于石英比色皿中，置于圆二色光谱仪中采集cd信号；置于紫外分光光度计中测试200～800nm的紫外吸收光谱；在280～500nm的激发波长下测试手性碳量子点的荧光发射光谱。
50.2)将手性碳量子点用超纯水配成0.5mg/ml溶液，超声分散处理20min，用移液枪吸取1ml溶液注入到马尔文zeta电位皿中，用马尔文激光粒度仪zs90中对手性碳量子点进行zeta电位测试。
51.3)将手性碳量子点用超纯水配成1mg/ml溶液，超声分散处理20min，用移液枪吸取10μl分散好的溶液逐滴滴加到300目透射电镜专用铜网中，室温下自然干燥24h，于200kv及300kv加速电压的透射电镜下观察。
52.4)将手性碳量子点粉末与干燥的溴化钾以1:100的质量比用天平准确称取，置于玛瑙研钵中研细，粉末转移至红外模具中，抽真空、加压3min，压片后采集傅里叶红外光谱数据。
53.5)聚集诱导发光效应测试：配制体积比v:v＝0％～100％的四氢呋喃与水的混合物，加入终浓度10μg/ml手性碳量子点，于340nm激发波长下测试荧光光谱。
54.具体测试结果如图1所示。具体的，图1a的圆二色光谱显示，l-cds与d-cds呈现出相反、对称的手性信号，表明碳量子点成功继承了左旋/右旋半胱氨酸原料的手性性质；图1b显示手性l/d-cds具有相似的zeta电位值；图1c、d的透射电子显微镜(tem)测试结果显
示，制备的手性碳量子点呈球形且分散均匀，平均粒径在4～5.5nm，其中l-cds的平均粒径为5.2nm，d-cds的平均粒径为4.3nm，具有良好的晶体结构，晶格间距为0.22或0.33nm；图1e、2e荧光光谱显示，手性碳量子点具有激发波长依赖的荧光发射特点，并在340nm的激发下有最大发射；图2a紫外光谱显示，手性碳量子点分别在275nm及320nm存在两个吸收峰，这归因于c＝c的π-π*跃迁和c＝o的n-π*跃迁；图2b的傅里叶变换的红外光谱图中，位于3400cm-1
处的宽峰和处于3207cm-1
的小驼峰归因于o-h和n-h的伸缩振动，2975和2920cm-1
处的峰来源于c-h，处于1610cm-1
和1135cm-1
分别可能与c＝o和c-o的伸缩振动有关，处于1380cm-1
的峰可能来源于c-n，n-h和coo-。其中，2550和1190cm-1
处的峰与s存在有关，分别归因于-s-h和c-s，与原料半胱氨酸对比，l/d-cds这两个位置的峰不明显，可能因为水热过程中聚合导致。由红外光谱可知，该手性碳量子点存在-cooh、-oh、-nh2等特征基团，这与碳量子点良好的水溶性特点有关。在手性碳量子点的聚集诱导发射行为测试中，图1f显示，在一定范围内碳量子点的荧光强度随thf所占体积比的增加而增强，d-cds和l-cds分别在thf：h2o＝60％、70％(v:v)时达到最大荧光强度。通过透射电镜进一步观察得到手性碳量子点在thf-h2o双组分体系中形成直径为20-30nm大的聚集颗粒，验证了l/d-cds具有聚集诱导效应。
55.实施例3手性碳量子点与细菌的共聚焦成像测试
56.所用测试菌株：革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌(s.aureus,atcc25923)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa,atcc43300)、粪肠球菌(e.faecalis,atcc29212)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis,cmcc(b)63501)。革兰氏阴性菌：大肠杆菌(e.coli,atcc25922)、奇异变形杆菌(p.mirabilis,pro10(ao250))、沙门氏菌(s.typhimurium,atcc14028)。真菌：白色念珠菌(c.albicans,atcc10231)、近平滑白色假丝酵母(c.parapsilosis,atcc22019)。用接种环分别挑取细菌单菌落于5ml lb肉汤培养基中，挑取白色念珠菌单菌落于沙氏葡萄糖真菌培养基中，在37℃200rpm下过夜振荡培养18h。将细菌、真菌经5000rpm离心3min收集，用灭菌的pbs缓冲液(10mm,ph＝7.4)重悬，调整细菌浓度1
×
106～107cfu/ml，将细菌、真菌与l/d-cds(最终浓度50μg/ml)于37℃摇床下200rpm孵育30min。孵育结束后，用灭菌pbs冲洗2次，最后用1ml pbs重悬，涡旋混匀。移液枪吸取10μl置于干净的载玻片上，用镊子小心盖上盖玻片，于激光共聚焦显微镜下用100倍油镜观察。
57.图3a、3b、5a、5b的共聚焦图像显示，经手性碳量子点处理30min后，四种革兰氏阳性菌和两种真菌分别在405、488、552nm三种激发波长的激光下显示出蓝、绿、红色荧光。图4a、b显示，测试的三种革兰氏阴性菌均未观察到碳量子点的明显的荧光，从而证明手性碳量子点在短时间内进入革兰氏阳性菌/真菌，而不能进入革兰氏阴性菌内。能将革兰氏阳性菌/真菌与革兰氏阴性菌较好地区分开。
58.实施例4手性碳量子点与细菌的流式细胞术测试
59.用接种环分别挑取测试菌株的单菌落于5ml lb肉汤培养基中，挑取白色念珠菌单菌落于沙氏葡萄糖真菌培养基中，在37℃ 200rpm下振荡培养18h。将细菌/真菌经5000rpm离心3min收集，用灭菌的pbs缓冲液(10mm,ph＝7.4)重悬，调整细菌浓度1
×
106～107cfu/ml，将细菌/真菌与l/d-cds(最终浓度50μg/ml)于37℃摇床下200rpm孵育30min，以pbs作为对照。孵育结束后，用灭菌pbs冲洗2次，最后用1ml pbs重悬，涡旋混匀，使用流式细胞仪定量检测细菌内手性碳量子点的荧光强度。
60.结果见图3、4、5。与对照组相比，流式细胞仪检测到革兰氏阳性菌/真菌中的荧光信号明显增加，而三种革兰氏阴性菌均检测不到明显的荧光信号。证明手性碳量子点可使革兰氏阳性菌/真菌与革兰氏阴性菌区较好地区分开。
61.以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。