用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置及方法

1.本公开涉及微流控技术领域，尤其涉及一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置及方法。


背景技术：

2.免疫荧光(immunofluorescence,if)是荧光显微成像中常用的标记技术，通过抗体对细胞中的目标蛋白进行标记，在荧光显微镜下可进行原位的成像，但普通的荧光显微镜分辨率仅在～200nm，难以看清细胞中的亚细胞器及一些结构的细节。单分子定位超分辨技术的出现，将荧光显微镜的分辨率提升了近10倍，是细胞结构、功能研究的利器。然而，单分子定位超分辨成像技术的应用，不仅需要专业的成像系统，更加需要稳定可靠的实验方案。
3.超分辨的免疫荧光实验，同样需要对细胞进行固定、通透、封闭、一抗标记、二抗标记等实验流程。但与普通免疫荧光不同的是，超分辨成像实验对信噪比要求较高，其免疫标记实验一般于专用共聚焦培养皿中进行，以保证成像后荧光图像的分辨率，而随着分辨率的提升，实验方案中的各种影响因素变得更加敏感，很难实现统一。
4.例如由一抗二抗尺寸带来的连接误差问题；不同固定液对细胞结构的固定效果不同；以及繁琐重复人工操作带来的人为误差等等，导致实验误差大、不利于成像结果的重复性且更加耗时。因此需要一种适用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记装置，用于解决上述问题。


技术实现要素：

5.本公开提供了一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置及方法，以至少解决现有技术中存在的实验误差大、成像结果的重复性差、实验耗时长等技术问题。
6.根据本公开的第一方面，提供了一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置，所述装置包括储液池、切换组件、芯片组件、废液池、控制组件以及分压阀；
7.所述储液池设置有多个，所述储液池用于存放免疫荧光标记所需的试剂；
8.所述切换组件用于切换不同储液池内的试剂进入所述芯片组件，所述切换组件与所述储液池通过管道连通，所述切换组件同时与所述控制组件连接；
9.所述芯片组件包括微流控芯片和共聚焦培养皿，所述芯片组件与所述切换组件连通，所述储液池内的试剂经过所述切换组件输送至所述微流控芯片组件；
10.所述废液池与所述芯片组件连通，反应后的试剂经过所述芯片组件流入废液池；
11.所述控制组件与所述储液池以及所述废液池连接，所述控制组件通过控制切换组件以及压力泵来控制不同试剂切换及试剂流速；
12.所述分压阀设置在所述控制组件与所述储液池之间，所述分压阀用于将输出气压均分到各储液池内。
13.在一可实施方式中，所述微流控芯片倒扣于所述共聚焦培养皿上，所述微流控芯
片的中间区域镂空，与所述共聚焦培养皿的中间区域形成反应区域。
14.在一可实施方式中，所述微流控芯片包括至少一组进液组件和出液组件，所述进液组件包括进口以及与进口连通的进液通道，所述进液通道与所述反应区域连通；所述出液组件包括出口以及与出口连通的出液通道。
15.在一可实施方式中，所述进液通道发散出多条连通的第一支路，试剂经过所述第一支路发散进入所述反应区域；
16.所述进液通道由多条连通的第二支路组成，反应后的试剂进入所述第二支路聚合流出。
17.在一可实施方式中，所述切换组件包括多通道切换端口以及输出端口，所述多通道切换端口设置有多个，所述多通道切换端口与所述储液池一一对应连通，所述输出端口与所述芯片组件连通，使多通道切换端口对应储液池的液体流入微流控芯片。
18.在一可实施方式中，所述控制组件包括压力泵和电子设备控制端，所述压力泵与所述储液池以及所述废液池连通，所述电子设备控制端用于控制所述压力泵，以实现对所述储液池内液体流速的控制以及所述废液池内液体流速的控制。
19.在一可实施方式中，所述电子设备控制端还用于控制所述切换组件的多通道切换端口，以实现对流入微流控芯片的试剂进行切换。
20.根据本公开的第二方面，提供了一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置的使用方法，该方法包括：
21.在储液池中分别加入固定液、通透液、封闭液、一抗、二抗以及pbs磷酸缓冲液；
22.将已接种细胞的共聚焦培养皿的小孔边缘擦拭干净，将微流控芯片倒扣于共聚焦培养皿中，插入钢针以便于通过毛细管连接微流控芯片；
23.将带有微流控芯片的共聚焦培养皿与切换组件及废液池分别连接；
24.启动压力泵和切换组件，设置好压力泵的输出压力值，以及在切换组件的控制软件中设置不同试剂切换的顺序及时长，储液池内的不同试剂会按实验顺序依次通过共聚焦培养皿的小孔，自动完成细胞的超分辨成像免疫标记实验。
25.根据本公开的第三方面，提供了一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记的方法，该方法包括：
26.细胞培养：将细胞接种于共聚焦培养皿的玻片上，共聚焦培养皿放置于细胞培养箱培养；
27.固定：移除共聚焦培养皿中的细胞培养液，加入固定液固定，固定结束之后，使用pbs磷酸缓冲液漂洗多次，以洗掉过量的固定液；
28.通透：漂洗之后加入通透液，对细胞进行通透，通透结束之后，使用pbs磷酸缓冲液漂洗多次，以洗掉过量的通透液；
29.封闭：加入封闭液，对细胞进行封闭；
30.一抗标记：吸走封闭液，加入封闭液稀释的一抗，对细胞进行孵育，结束之后，使用pbs磷酸缓冲液漂洗多次，以洗掉过量的一抗；
31.二抗标记：一抗漂洗之后，避光条件下加入封闭液稀释的二抗，对细胞进行孵育；结束之后，使用pbs磷酸缓冲液漂洗多次，以洗掉过量的二抗，完成标记。
32.本发明提供了一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置及方法，该
装置应用微流控的流体控制技术，设计了贴合共聚焦培养皿的微流控芯片用于超分辨免疫荧光标记，通过在储液池内加入不同液体，应用控制组件(压力泵和电子设备控制端)对流体进行控制切换，以实现整个免疫标记实验的自动化，通过标准化的操作，能够提高免疫标记实验的重复性和精确度，极大的减少试剂的消耗，同时降低整个操作流程的时长。
33.应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
附图说明
34.通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：
35.在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。
36.图1示出了本公开实施例一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置的结构示意图；
37.图2示出了本公开实施例提供的共聚焦培养皿的结构示意图；
38.图3示出了本公开实施例提供的微流控芯片的结构示意图。
39.图中标号说明：1、储液池；2、切换组件；21、多通道切换端口；22、输出端口；3、芯片组件；31、微流控芯片；311、进液组件；3111、进口；3112、进液通道；3113、第一支路；312、出液组件；3121、出口；3122、出液通道；3123、第二支路；32、共聚焦培养皿；4、废液池；5、控制组件；51、压力泵；511、正压源接口；512、真空源接口；52、电子设备控制端；6、分压阀。
具体实施方式
40.为使本公开的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而非全部实施例。基于本公开中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
41.目前超分辨的免疫荧光实验，需要对细胞进行固定、通透、封闭、一抗标记、二抗标记等实验流程，但与普通免疫荧光不同的是，超分辨成像实验对信噪比要求较高，其免疫标记实验一般于专用共聚焦培养皿中进行，以保证成像后荧光图像的分辨率，而随着分辨率的提升，实验方案中的各种影响因素变得更加敏感，很难实现统一。比如：由一抗二抗尺寸带来的连接误差问题；不同固定液对细胞结构的固定效果不同；以及繁琐重复人工操作带来的人为误差等等，因此超分辨成像更加需要将实验流程自动化、标准化。而为了保证成像质量，超分辨的样本制备要相对复杂，传统的人工操作耗时耗力，不利于成像结果的重复性。因此，本发明提出一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置及方法，保证成像结果的重复性，降低实验时长。
42.微流控技术是能够在微米、纳米尺度对液体操控的技术，其将样本的制备，分离，检测集成到一张芯片上完成，也被称为微全分析系统或者芯片实验室，已经被广泛应用于细胞培养、蛋白纯化、抗原检测、器官芯片，高通量筛选等方面，具有体积小、传热快，微小尺度直接操控生物样本的优点，能够对微小细胞进行精确的操控，消耗更少量的试剂，产生更
稳定的平流用于实验。
43.实施例1
44.本发明第一方面提供一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置，如图1所示为该装置的结构示意图，该装置包括：储液池1、切换组件2、芯片组件3、废液池4、控制组件5以及分压阀6。
45.储液池1设置有多个，储液池1用于存放免疫荧光标记所需的试剂，例如本发明的免疫荧光标记需要使用的试剂分别为固定液、通透液、封闭液、一抗、二抗、pbs磷酸缓冲液，那么本实施例的储液池1设置6个，若还需要使用其它试剂，则可以相应增加储液池1的数量，本发明对此不做限制。每个储液池1内均设置相应的管道用于输送流体，管道的材质可以依据试剂的性质选择。
46.切换组件2为多通道切换阀，包括多通道切换端口21和输出端口22，切换阀端口21使用的数量至少和储液池1的数量一致，不能少于储液池1的数量，储液池1与切换阀端口21通过管道连通。多通道切换阀用于切换不同储液池1内的液体，例如本实施例使用的多通道切换阀至少包括六通道切换阀端口21，也可以使用更多通道的切换阀端口21，例如最多可使用十二通道切换阀端口21的多通道切换阀。输出端口22与芯片组件3连通，使多通道切换端口21对应储液池1的液体流入芯片。
47.芯片组件3包括微流控芯片31和共聚焦培养皿32，共聚焦培养皿32如图2所示，共聚焦培养皿32中间为圆形凹槽，凹槽底部封有玻片，用于培养细胞。微流控芯片31倒扣于共聚焦培养皿32上，为了进一步连接微流控芯片31，在微流控芯片31的边缘打孔，然后在孔内插入钢针，钢针穿过孔内插入至共聚焦培养皿32的小孔内，从而能够将微流控芯片31连接至流体系统中。
48.如图3所示为微流控芯片31的结构示意图，微流控芯片31的中间圆形区域为圆形凹槽(凹槽深度为50μm)，可与共聚焦培养皿32贴合。微流控芯片31中间的圆形区域与下层的共聚焦培养皿32，形成反应区域，细胞免疫荧光的过程均在此区域内完成。微流控芯片31包括至少一组进液组件311和出液组件312，进液组件311包括进口3111以及与进口3111连通的进液通道3112，进液通道3112与反应区域连通；出液组件312包括出口3121以及与出口3121连通的出液通道3122，出液通道3122与反应区域连通。
49.在示例中，进液通道3112发散出四条连通的第一支路3113，试剂经过第一支路3113流入反应区域。在毫米级的反应区域内通过对流体流速控制可实现稳定的层流状态，可有效控制固液界面的生物分子扩散程度，实现加速细胞免疫标记的速度。通过切换不同试剂，自动化完成细胞样本的免疫标记，可实现对不同试剂用量的精确操控，同时减少试剂消耗。
50.进液通道3112由多条连通的第二支路3123组成，沿着流体的流出方向，第二支路3123的分支越来越少，直至试剂聚集至出口3121流出，免疫荧光标记过程，每一步骤结束后，即反应后的试剂沿着第二支路3123聚合流出。
51.如图1所示，控制组件5包括压力泵51和电子设备控制端52，压力泵51与储液池1以及废液池4连通，压力泵51为正负压高精密微流控压力泵51，可同时对液体进行推拉操作，并通过调整压力的大小对流速进行控制。压力泵51上方设置有正压源接口511以及真空源接口512，正压源接口511与储液池1通过管道连通。
52.分压阀6设置在压力泵51的正压源接口511与储液池1之间，分压阀6用于压力泵51后均分气压至储液池1。电子设备控制端52为计算机、手机等智能电子设备，本发明对电子设备控制端52的具体电子产品不做限制，电子设备控制端52用于控制压力泵51的压力输出值，以实现对储液池1内液体输出端的流速控制；还用于控制切换组件2的多通道切换端口21，以控制不同试剂切换，从而实现对流入微流控芯片的试剂进行切换。
53.废液池4与微流控芯片31的出口3121通过管道连接，废液池4用于存放实验过程中产生的废液，例如储液池1内的试剂进入反应区域反应结束后，则经过出液通道3122输送至废液池4。
54.实施例2
55.本发明第二方面还提供一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记微流控装置的使用方法，该方法包括：
56.s1、在储液池1中分别加入固定液、通透液、封闭液、一抗、二抗以及pbs磷酸缓冲液；
57.s2、将已接种细胞的共聚焦培养皿32的小孔边缘擦拭干净，将微流控芯片31倒扣于共聚焦培养皿32中，插入钢针以连接微流控芯片31；
58.s3、将带有微流控芯片31的共聚焦培养皿32与切换组件2及废液池4分别连接；
59.s4、启动压力泵51和切换组件2，设置好压力泵51的输出压力值，以及在切换组件2的控制软件中设置不同试剂的切换顺序及时长，储液池1内的不同试剂会按实验顺序依次通过共聚焦培养皿32的小孔，自动完成细胞的超分辨成像免疫标记实验。
60.实施例3
61.一种用于超分辨成像的自动化免疫荧光标记的方法，以cos-7细胞为例，该方法包括：
62.a1、细胞培养：将以cos-7细胞接种于共聚焦培养皿32的玻片上，加入细胞培养液放置于细胞培养箱培养，培养至细胞贴壁之后可对细胞样本进行免疫荧光标记；
63.a2、固定：除去共聚焦培养皿32中的细胞培养液，加入200μl固定液固定15min，固定结束之后，使用pbs磷酸缓冲液漂洗多次，以洗掉过量的固定液；
64.a3、通透：漂洗之后加入200μl通透液，对细胞进行通透，时间为10min，通透结束之后，使用pbs磷酸缓冲液漂洗多次，以洗掉过量的通透液；
65.a4、封闭：加入200μl封闭液，对细胞进行封闭90min；
66.a5、一抗标记：吸走封闭液，加入封闭液稀释的一抗，对细胞进行60min孵育，结束之后，使用pbs磷酸缓冲液漂洗多次，以洗掉过量的一抗；
67.a6、二抗标记：一抗漂洗之后，避光条件下加入封闭液稀释的二抗，对细胞进行40min孵育；结束之后，使用pbs磷酸缓冲液漂洗多次，以洗掉过量的二抗，完成标记。
68.上述a1-a5步骤完成后，即完成了对细胞的免疫荧光标记，该方法通过一抗对目标蛋白定位，通过带荧光染料的二抗呈现荧光结果并进行一定程度的信号放大。荧光标记后，共聚焦培养皿32中的样本可以直接加入成像缓冲液进行dstorm(直接随机光学重建显微镜)超分辨成像，也可-20℃保存以备后续使用。
69.应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，
只要能够实现本公开公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。
70.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
71.以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。