一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术免疫学检测，尤其涉及一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒。

背景技术：

1、在重金属快速检测方法中，以抗原抗体反应为基础的快速检测方法有诸多研究，包括酶联免疫吸附法、生物芯片法等，大多需要包被、封闭、反应、孵育、洗板等复杂操作，而且均以人工操作为主，容易对实验结果引入人为误差，过程条件控制无法保证，限制了其在市场上的广泛推广与应用。因此，在面临多指标、多样品快速自动化检测的需求下，开发一种新型、快速、高灵敏、可自动化的重金属检测方法尤为重要。

2、

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，人工操作步骤大大减少，抗原抗体用量大幅减少，成本大大降低，可用于基层实验室对于重金属食品及制品的大范围筛选和检测，配合poct检测平台，可实现重金属检测自动化。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，包括如下组分：重金属抗原、抗重金属抗体、链霉亲和素包被的磁微粒、发光标记物偶联的抗igg抗体、与发光标记物相适用的底物液、重金属基体标准溶液、反应稀释液以及洗涤液。

4、作为优选，所述重金属抗原和抗重金属抗体为生物素化重金属抗原和抗重金属抗体或重金属抗原和生物素化抗重金属抗体。

5、作为优选，所述生物素化重金属抗原为生物素和重金属抗原形成的复合物；所述重金属抗原由重金属、重金属螯合剂、载体蛋白偶联形成；所述生物素化抗重金属抗体为生物素和抗重金属抗体偶联形成复合物；

6、所述重金属螯合剂为乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸、2-(4-氨基苄基)-二亚乙基三胺五乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-n,n,n,n-四乙酸中的一种或多种；所述载体蛋白为卵清蛋白、血清白蛋白或锁钥蓝蛋白；所述生物素化抗重金属抗体为生物素、抗重金属抗体形成的复合物。

7、作为优选，所述抗重金属抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体或多克隆抗体经辛酸-硫酸铵法纯化。

8、作为优选，所述链霉亲和素包被的磁微粒由链霉亲和素与磁微粒偶联制备，所述磁微粒以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基、甲苯磺酰基、羧基或环氧基基团；所述磁微粒的粒径为1～2μm。

9、作为优选，所述发光标记物偶联的抗igg抗体中的发光标记物为碱性磷酸酶、吖啶酯或鲁米诺；所述发光标记物偶联的抗igg抗体中的抗igg抗体为抗重金属抗体同源生产的可识别的抗体，所述抗igg抗体的浓度为0.01～1mg/ml。

10、作为优选，所述重金属基体标准溶液是由0～0.5mg/kg不同浓度梯度的匹配粮食有证标准物质，采用稀酸提取的方式制得的工作标准曲线；所述稀酸提取液为2～6％硝酸溶液。水样标准溶液是由0～2ng/ml不同浓度绘制成工作标准曲线。

11、所述反应稀释液由0.01～1mmtris缓冲液、0.01～1mm重金属螯合剂、0.08～0.12％吐温、0.4～0.6％牛血清白蛋白、0.01-1mph调节剂组成，所述重金属螯合剂为乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸、2-(4-氨基苄基)-二亚乙基三胺五乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-n,n,n,n-四乙酸中的一种或多种；所述ph调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、三羟甲基氨基甲烷及其盐酸盐、盐酸、硝酸中的一种或多种。

12、作为优选，所述试剂盒还包括反应管；所述反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

13、本发明提供了一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：重金属抗原、抗重金属抗体、链霉亲和素包被的磁微粒、发光标记物偶联的抗igg抗体、与发光标记物相适用的底物液、重金属基体标准溶液、反应稀释液以及洗涤液。本发明以抗体为识别元件，以生物链霉亲和素为信号方法手段，借助磁微粒载体，将抗体与磁微粒偶联，利用抗原抗体特异性结合的原理，在磁微粒表面反应、转移，形成磁微粒抗体-抗原-抗igg抗体-碱性磷酸酶复合物，最终以碱性磷酸酶催化化学发光底物产生化学发光。

14、此外，使用本发明试剂盒检测方法还具有以下优点：(1)检测速度快、稳定、无放射性污染，在没有磁微粒场存在的情况下，磁微粒悬浮在液体中，使得抗原-抗体反应类似于均相反应；磁微粒在外加磁微粒场的作用下可方便地分离、洗涤快速，可在20分钟内对至少8个样本进行检测结果的判断。(2)灵敏度高(方法检出限为0.04ng/ml)。(3)特异性强(与其他元素无交叉反应)。(4)精密度良好(回收率为88％～112％，rsd％<10％)。(5)本发明试剂盒及使用方法搭配poct平台，可实现多通量自动化操作，大大提高了检测效率，简化了操作，减轻人员负担。(6)本发明试剂盒的有效期，经37℃加速稳定性及2-8℃真实稳定性试验证实，本产品在37℃可存放7天以上，在2-8℃至少可存放14个月。(6)成本低，与市场上基于免疫方法的同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有实际应用价值。

技术特征：

1.一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，包括如下组分：重金属抗原、抗重金属抗体、链霉亲和素包被的磁微粒、发光标记物偶联的抗igg抗体、与发光标记物相适用的底物液、重金属基体标准溶液、反应稀释液以及洗涤液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重金属抗原和抗重金属抗体为生物素化重金属抗原和抗重金属抗体或重金属抗原和生物素化抗重金属抗体。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化重金属抗原为生物素和重金属抗原形成的复合物；所述重金属抗原由重金属、重金属螯合剂、载体蛋白偶联形成；所述生物素化抗重金属抗体为生物素和抗重金属抗体偶联形成复合物；

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗重金属抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述单克隆抗体或多克隆抗体经辛酸-硫酸铵法纯化。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁微粒由链霉亲和素与磁微粒偶联制备，所述磁微粒以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基、甲苯磺酰基、羧基或环氧基基团；所述磁微粒的粒径为1～2μm。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述发光标记物偶联的抗igg抗体中的发光标记物为碱性磷酸酶、吖啶酯或鲁米诺；所述发光标记物偶联的抗igg抗体中的抗igg抗体为抗重金属抗体同源生产的可识别的抗体，所述抗igg抗体的浓度为0.01～1mg/ml。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述重金属基体标准溶液是由0～0.5mg/kg不同浓度梯度的匹配粮食有证标准物质，采用稀酸提取的方式制得的工作标准曲线；所述稀酸提取液为2～6％硝酸溶液。水样标准溶液是由0～2ng/ml不同浓度绘制成工作标准曲线。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述反应稀释液由0.01～1mm tris缓冲液、0.01～1mm重金属螯合剂、0.08～0.12％吐温、0.4～0.6％牛血清白蛋白、0.01-1m ph调节剂组成，所述重金属螯合剂为乙二胺四乙酸、二乙基三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四羧酸、2-(4-氨基苄基)-二亚乙基三胺五乙酸、1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-n,n,n,n-四乙酸中的一种或多种；所述ph调节剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、三羟甲基氨基甲烷及其盐酸盐、盐酸、硝酸中的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤剂为0.01～0.02m tris-hcl缓冲液、0.1～0.2％吐温-20组成。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应管；所述反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

技术总结
本发明涉及生物技术免疫学检测技术领域。本发明提供了一种检测重金属的磁微粒化学发光试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：重金属抗原、抗重金属抗体、链霉亲和素包被的磁微粒、发光标记物偶联的抗IgG抗体、与发光标记物相适用的底物液、重金属基体标准溶液、反应稀释液以及洗涤液。本发明的试剂盒采用磁微粒化学发光检测方法，具有高灵敏、高特异性、高准确度的特点，与传统ELISA方法和胶体金免疫层析试纸条方法相比，人工操作步骤大大减少，抗原抗体用量大幅减少，成本大大降低，并可实现自动化检测，可用于基层实验室对于食品及制品重金属的大范围筛选和检测。

技术研发人员：周明慧,王松雪,田巍,刘洪美
受保护的技术使用者：国家粮食和物资储备局科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13