一种肌钙蛋白快速检测的生物传感器的制备方法

1.本发明属于临床诊断技术领域，涉及一种肌钙蛋白快速检测的生物传感器的制备方法。


背景技术：

2.根据世界卫生组织（who）的统计数据，到2019年全球有超过1960万人死于心血管疾病（cvd），这也是目前造成死亡最多的疾病之一。在众多心血管疾病中，急性心肌梗死（ami）对生命的威胁最大，由于其突发性和急迫性，每年能够造成约1670万人死亡。更重要的是，受损的心肌细胞是不可再生的，所以后期治疗也会导致不可逆的心肌坏死，提高心脏骤停风险。因此，快速准确地诊断急性心肌梗死是抢进行生命抢救的关键。临床医学上通常会采用心电图、冠状动脉造影和血液分析等手段来诊断ami，其中心电图是根据st段升高或降低的信号快速指示心肌缺血，然而这种方法通常只有在患者出现严重的临床症状时才会产生明显的变化；冠状动脉造影术依靠心血管造影剂目测观察冠状动脉狭窄或阻塞的病变，但是这是一种具有侵入性且耗时的方法，不仅无法满足快速诊断的要求，还需要依赖于特定的仪器和专业的分析人员。血液检测心肌钙蛋白i（ctni）是一种可靠且高度敏感的检测方式，能够准确评估ami的病程。目前，固相色谱免疫分析法（spci）、电化学发光法（ecl）和电化学生物传感器都能用于检测血液中的ctni含量，虽然前两者能够在短时间内获得结果，但是繁琐的操作和严苛的检测环境制约了其进一步发展。


技术实现要素：

3.本发明针对目前肌钙蛋白诊断过程中存在的时效性差、灵敏度低、非原位检测等问题，提出一种新型的肌钙蛋白快速检测的生物传感器的制备方法及其应用。
4.为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：一种肌钙蛋白快速检测的生物传感器的制备方法，其具体步骤如下：（1）氧化锌纳米花阵列模板制备：配制一定浓度的硝酸锌溶液，溶剂为乙醇，得到前驱液；然后将导电基底置于旋涂仪上，取适量前驱液滴在导电基底表面，以一定转速进行旋涂。旋涂一段时间后，将导电基底置于马弗炉中高温煅烧一定时间，而后将导电基底取出，获得zno晶种修饰的导电基底。此后配制含硝酸锌与络合剂的反应母液，将晶种修饰的基底置于反应母液中，在一定温度下进行zno纳米花的生长。经过一段时间后取出导电基底并用去离子水冲洗，室温下干燥一段时间后获得zno纳米花模板。
5.（2）普鲁士蓝空心纳米花阵列的制备：配制普鲁士蓝反应溶液a和b，其中a为过渡金属盐溶液与表面活性剂的混合溶液，b为过渡金属氰化钾溶液。将zno修饰的基底首先浸泡在b 溶液中一段时间进行预反应，然后将a溶液与b溶液混合并搅拌均匀，期间保持导电基底正面朝上。将反应液在恒温条件下静置反应一定时间，而后取出导电基底，用去离子水冲洗。然后直接将基底置于一定浓度的酸溶液中，反应后取出，用去离子水冲洗并恒温干燥一定时间，获得基于普鲁士蓝空心纳米花阵列的修饰电极。
6.（3）肌钙蛋白生物传感电极的制备：配制一定浓度的肌钙蛋白特异性dna探针溶液，取适量滴涂于修饰电极表面，然后进行低温反应使得探针固定于传感电极表面，而后取出用去离子水冲洗除去未完全结合的探针，低温保存随取随用。
7.作为优选，步骤（1）中前驱液的硝酸锌浓度为10-50mm，导电基底为导电玻璃、金片、铜片中的任意一种，基底上前驱体溶液用量为5-100μl，旋涂转速为500r/min，时间为60s；前驱体修饰的基底煅烧温度为300-500℃，煅烧时间为10-360min。
8.作为优选，步骤（1）中反应母液的硝酸锌浓度为1-30mm，络合剂为柠檬酸钠、乌洛托品、甲醇中的任意一种，浓度为1-50mm；zno纳米花阵列生长时间为3-12h，反应温度为60-100℃；反应后所得zno修饰的导电基底在室温下干燥时间不少于12h。
9.作为优选，步骤（2）中普鲁士蓝反应溶液a的过渡金属盐为fecl3、cucl2、nicl2中的任意一种，浓度为0.5-20mm；表面活性剂为柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠中的任意一种，浓度为1-30mm；b溶液中过渡金属氰化钾溶液为亚铁氰化钾、钴氰化钾中的任意一种，浓度为0.5-25mm，反应溶液a与b的体积比为1:1。
10.作为优选，步骤（2）中zno基底与b溶液的预反应时间为2h；pb在zno表面的合成时间为12-36h，合成温度为4-60℃。去除模板的酸溶液为盐酸、硫酸、硝酸中的任意一种，浓度为10-200mm，在酸溶液中的反应时间为2-6h；干燥温度为80℃，时间为8h。
11.作为优选，步骤（3）中dna探针溶液浓度为1-20μm，滴涂于修饰电极表面的用量为20-80μl，低温反应时间为12-24h，温度为4℃；低温保存的温度也为4℃。
12.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：1. 本发明基于电化学生物传感技术，基于高比表面积和电催化活性的普鲁士蓝纳米花制备了高性能的生物传感器，表现出优异的电化学生物传感性能。
13.2. 基于高性能的肌钙蛋白生物传感器能够在4分钟内快速实现肌钙蛋白i的精准快速检测，极大提升了心肌梗死疾病的诊断精准度和救助效率。
14.3. 该生物传感器在成分复杂的真实血清样本中仍能够对肌钙蛋白i具有优异的选择性，抗干扰能力强。
附图说明
15.图1为zno纳米花阵列和普鲁士蓝纳米花阵列的电镜图。
16.图2为基于普鲁士蓝纳米花阵列的生物传感器对肌钙蛋白i的信号响应。
具体实施方式
17.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
18.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
19.实施例1如图1和图2，本实施例提供一种肌钙蛋白快速检测的生物传感器的制备方法，包
括如下步骤。
20.（1）氧化锌纳米花阵列模板制备：配制10mm的硝酸锌溶液，溶剂为乙醇，作为前驱液；然后将导电玻璃置于旋涂仪上，取100μl前驱液滴在导电玻璃表面，以500r/min的转速进行旋涂。旋涂60s后，将导电玻璃置于马弗炉中300℃下煅烧360min，而后获得zno晶种修饰的导电玻璃。此后配制含1mm硝酸锌与1mm柠檬酸钠的反应母液（体积不做限制，能完全浸没即可），将晶种修饰的基底置于反应母液中，在100℃下进行zno纳米花的生长。经过3h反应后取出导电基底并用去离子水冲洗10s以上，室温下干燥12h后获得zno纳米花模板。
21.（2）普鲁士蓝空心纳米花阵列的制备：分别配制50ml普鲁士蓝反应溶液a和b，其中a为0.5mm fecl3与1mm柠檬酸钠的混合溶液，b为0.5mm亚铁氰化钾溶液。将zno修饰的基底预先浸泡在b 溶液中2h，然后将a溶液与b溶液混合并搅拌均匀，期间保持导电基底正面朝上。将反应液在4℃下静置反应36h，而后取出导电玻璃，用去离子水冲洗10s以上。然后直接将基底置于10mm的盐酸溶液中，反应6h后取出，用去离子水冲洗10s以上后在80℃干燥8h，获得基于普鲁士蓝空心纳米花阵列的修饰电极。
22.（3）肌钙蛋白生物传感电极的制备：配制1μm的肌钙蛋白i（ctni）特异性dna探针溶液（购自上海生工生物科技有限公司），取80μl滴涂于修饰电极表面，然后在4℃下进行反应12h使得探针固定于传感电极表面，而后取出用去离子水冲洗除去未完全结合的探针，在4℃保存随取随用。
23.采用上海辰华chi660e电化学工作站的差分脉冲技术进行生物传感器对ctni的性能测试，电压变化范围为-0.1-0.6v，增幅为0.005v，将导电基底（工作电极）、铂丝（对电极）和ag/agcl（参比电极）与电化学工作站上相应的电极线连接。所得生物传感器对ctni的检测极限为1pg/ml，线性范围均为2pg/ml-150ng/ml，检测时间仅为4min。在完成标准曲线测试后，将基于pb纳米花阵列的生物传感器保存在4℃的pbs缓冲溶液中30天，其响应信号为初始信号的90%，表明该ctni传感器具有优异的稳定性。
24.在此基础上，将该生物传感器用于真实血样中ctni含量的检测。首先将全血通过3000rpm离心提取血清，将一定量的血清加入检测体系中，获取了添加血清前后检测信号的差异，并通过检测标准曲线获得ctni在真实血样中的浓度。检测结果见表1，利用该生物传感器能够准确报告全血中ctni的含量，其检测结果与商品化的生化分析仪相一致，且检测误差较小，表明该传感器能够在复杂的血清环境中实现ctni的精准检测，表现出优异的抗干扰能力和广阔的实际应用前景。
25.实施例2本实施例及后续实施例中未特殊说明之处，与实施例1条件一致。本实施例提供一种肌钙蛋白快速检测的生物传感器的制备方法，包括如下步骤。
26.（1）氧化锌纳米花阵列模板制备：配制50mm的硝酸锌溶液，溶剂为乙醇；然后将金片置于旋涂仪上，取5μl前驱液滴在金片表面，以500r/min的转速进行旋涂。经过60s的旋涂后，将金片基底置于马弗炉中500℃煅烧10min，而后获得zno晶种修饰的金片。此后配制含30mm硝酸锌与50mm甲醇的反应母液，将晶种修饰的基底置于反应母液中，在60℃下进行zno纳米花的生长。经过12h反应后取出导电基底并用去离子水冲洗，室温下干燥12h后获得zno纳米花模板。
27.（2）普鲁士蓝空心纳米花阵列的制备：分别配制50ml普鲁士蓝反应溶液a和b，其中
a为20mm cucl2与30mm十二烷基硫酸钠的混合溶液，b为25mm钴氰化钾溶液。将zno修饰的基底预先浸泡在b 溶液中2h，然后将a溶液与b溶液混合并搅拌均匀，期间保持导电基底正面朝上。将反应液在60℃下静置反应12h，而后取出金片，用去离子水冲洗。然后直接将基底置于200mm的硫酸溶液中，反应2h后取出，用去离子水冲洗并在80℃干燥8h，获得基于普鲁士蓝空心纳米花阵列的修饰电极。
28.（3）肌钙蛋白生物传感电极的制备：配制20μm的肌钙蛋白i（ctni）特异性dna探针溶液，取20μl滴涂于修饰电极表面，然后在4℃下进行反应24h使得探针固定于传感电极表面，而后取出用去离子水冲洗除去未完全结合的探针，在4℃保存随取随用。
29.采用上海辰华chi660e电化学工作站的差分脉冲技术进行生物传感器对ctni的性能测试，电压变化范围为-0.1-0.6v，增幅为0.005v，将导电基底（工作电极）、铂丝（对电极）和ag/agcl（参比电极）与电化学工作站上相应的电极线连接。所得生物传感器对ctni的检测极限为1pg/ml，线性范围均为2pg/ml-150ng/ml，检测时间仅为4min。在完成标准曲线测试后，将基于pb纳米花阵列的生物传感器保存在4℃的pbs缓冲溶液中30天，其响应信号为初始信号的92%，表明该ctni传感器具有优异的稳定性。
30.在此基础上，将该生物传感器用于真实血样中ctni含量的检测。首先将全血通过3000rpm离心提取血清，将一定量的血清加入检测体系中，获取了添加血清前后检测信号的差异，并通过检测标准曲线获得ctni在真实血样中的浓度。检测结果见表1，利用该生物传感器能够准确报告全血中ctni的含量，其检测结果与商品化的生化分析仪相一致，且检测误差较小，表明该传感器能够在复杂的血清环境中实现ctni的精准检测，表现出优异的抗干扰能力和广阔的实际应用前景。
31.实施例3一种肌钙蛋白快速检测的生物传感器的制备方法，包括如下：（1）氧化锌纳米花阵列模板制备：配制20mm的硝酸锌溶液，溶剂为乙醇；然后将铜片置于旋涂仪上，取15μl前驱液滴在铜片表面，以500r/min的转速进行旋涂。经过60s的旋涂后，将铜基底置于马弗炉中400℃煅烧200min，而后获得zno晶种修饰的铜片。此后配制含15mm硝酸锌与30mm乌洛托品的反应母液，将晶种修饰的基底置于反应母液中，在80℃下进行zno纳米花的生长。经过8h反应后取出导电基底并用去离子水冲洗，室温下干燥12h后获得zno纳米花模板。
32.（2）普鲁士蓝空心纳米花阵列的制备：分别配制50ml普鲁士蓝反应溶液a和b，其中a为10mm nicl2与15mm十二烷基硫酸钠的混合溶液，b为20mm亚铁氰化钾溶液。将zno修饰的基底预先浸泡在b 溶液中2h，然后将a溶液与b溶液混合并搅拌均匀，期间保持导电基底正面朝上。将反应液在25℃下静置反应24h，而后取出铜片，用去离子水冲洗。然后直接将基底置于100mm的硝酸溶液中，反应4h后取出，用去离子水冲洗并在80℃干燥8h，获得基于普鲁士蓝空心纳米花阵列的修饰电极。
33.（3）肌钙蛋白生物传感电极的制备：配制10μm的肌钙蛋白i（ctni）特异性dna探针溶液，取50μl滴涂于修饰电极表面，然后在4℃下进行反应16h使得探针固定于传感电极表面，而后取出用去离子水冲洗除去未完全结合的探针，在4℃保存随取随用。
34.采用上海辰华chi660e电化学工作站的差分脉冲技术进行生物传感器对ctni的性能测试，电压变化范围为-0.1-0.6v，增幅为0.005v，将导电基底（工作电极）、铂丝（对电极）
和ag/agcl（参比电极）与电化学工作站上相应的电极线连接。所得生物传感器对ctni的检测极限为0.8pg/ml，线性范围均为1pg/ml-150ng/ml，检测时间仅为4min。在完成标准曲线测试后，将基于pb纳米花阵列的生物传感器保存在4℃的pbs缓冲溶液中30天，其响应信号为初始信号的90%，表明该ctni传感器具有优异的稳定性。
35.在此基础上，将该生物传感器用于真实血样中ctni含量的检测。首先将全血通过3000rpm离心提取血清，将一定量的血清加入检测体系中，获取了添加血清前后检测信号的差异，并通过检测标准曲线获得ctni在真实血样中的浓度。检测结果见表1，利用该生物传感器能够准确报告全血中ctni的含量，其检测结果与商品化的生化分析仪相一致，且检测误差较小，表明该传感器能够在复杂的血清环境中实现ctni的精准检测，表现出优异的抗干扰能力和广阔的实际应用前景。
36.实施例4本实施例和实施例3的不同之处在于，不预先制备zno纳米花阵列模板而是直接在导电基底上直接合成普鲁士蓝，其余条件保持不变。所得生物传感器对ctni的检测极限为100pg/ml，线性范围均为0.25ng/ml-50ng/ml，相比于模板法合成的普鲁士蓝纳米花阵列的检测性能有明显降低。
37.实施例5本实施例和实施例3的不同之处在于，在zno模板外合成普鲁士蓝后不用酸溶液去除模板，其余条件保持不变。所得生物传感器对ctni没有明显信号响应。
38.实施例6本实施例和实施例3的不同之处在于，普鲁士蓝合成溶液a与b中有效成分的浓度示实施例3中的10倍，其余条件保持不变。所得生物传感器对ctni的检测性能与实施例4中生物传感器的性能相近。
39.从上述实施例中所得传感芯片的检测性能对比可以发现，传感材料的微观结构对生物传感器的检测性能起至关重要的作用。普鲁士蓝类材料具有良好的电催化活性，但是电子传递能力较差，颗粒之间团聚现象也较为严重，因而直接使用普鲁士蓝作为传感材料已经无法满足生物传感的性能要求。为了解决这一难题，需要提高普鲁士蓝分散性，并且强化其电子传输能力。zno纳米花阵列能够将传感电极表面划分为多个“孤岛”，有效降低材料的团聚效应，同时由于zno表面活性位点丰富，常作为模板进行其他材料的生长。因此本发明将普鲁士蓝和zno的有益特性相结合，利用zno纳米花阵列的分散效应降低普鲁士蓝的团聚，同时脱除zno模板后形成的空心普鲁士蓝纳米花阵列极大提升了修饰层的电子传递能力，因而所制备的传感器表现出优异的ctni检测能力。
40.对比实施例4与实施例3可以发现，空心结构的普鲁士蓝纳米花阵列相比于常规的普鲁士蓝多层堆积修饰电极而言具有更优异的ctni检测性能，这是由于空心结构带来的导电性提升，以及普鲁士蓝分散性提升双重增益。若不去除zno模板而制成pb/zno复合结构，由于zno更差的导电性，难以进行催化电子的产生和传递，因而实施例5中无法获得明显的ctni检测信号。同时，较高的pb合成速率更容易在溶液相中合成大量普鲁士蓝颗粒，难以沉积到zno表面，因而实施例6中无法获得普鲁士蓝纳米花阵列，脱除模板后只能获得坍塌的pb多层无序堆积结构，由此也表明普鲁士蓝的合成速率是形成普鲁士蓝纳米花阵列的决定性因素。
41.表1为实施例1-3制得的生物传感器进行血清中ctni的检测结果，其中alt表示肌钙蛋白i，参考数据来自迈瑞全自动生化分析仪。
42.表1 真实血样中肝炎标志物测试结果（谷丙转氨酶、谷草转氨酶）从表1结果来看，实施例1-3制得的生物传感器能够实现真实血清中ctni的准确检测，具有极低的检测限和宽的线性范围，表现出优异的抗干扰能力。此外，所制备的传感器能够在4℃的pbs缓冲溶液中保存30天，其响应信号仍能够达到初始信号的92%，表现出优异的长期稳定性。
43.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。