荧光染色剂及其制备方法、染色方法与流程

1.本发明涉及病原菌检测技术领域，特别是涉及一种荧光染色剂及其制备方法、染色方法。


背景技术：

2.目前，阴道分泌物检测有湿片法、革兰氏染色法、干化学酶法以及荧光染色法等。湿片法和革兰氏染色法对操作人员要求较高，需要操作人员有一定的技术经验；干化学酶法易受多种因素干扰导致假阳性高；荧光染色法能同时对阴道分泌物中多种组分进行染色使其形态较易清晰辨认，荧光染色试剂染色时间一般为1min左右，相较其他方法，荧光染色法染色时间虽已有较大改善，但对于样本量大的医院，染色时间仍需进一步提高。


技术实现要素：

3.基于此，有必要提供一种染色时间短且对阴道分泌物染色效果好的荧光染色剂及其制备方法。
4.此外，还提供一种染色时间短且对阴道分泌物染色效果好的染色方法。
5.一种荧光染色剂的制备方法，包括以下步骤：
6.将a剂、b剂、交联剂和c剂混合，制备混合液；及
7.将所述混合液在30℃～60℃条件下反应4h以上，制备荧光染色剂；
8.所述a剂包括纳米材料，所述纳米材料包括纳米四氧化三铁和纳米二氧化硅中的至少一种，所述b剂包括能够与核酸结合的荧光染料，以制备10
×
荧光染色剂计，所述纳米材料在所述混合液中的浓度为0.05％(m/v)～0.1％(m/v)，所述荧光染料在所述混合液中的浓度为1％(m/v)～50％(m/v)；
9.所述c剂包括1％(m/v)～20％(m/v)的甘油、0.1％(m/v)～5％(m/v)的二甲基亚砜和缓冲液。
10.上述荧光染色剂的制备方法通过采用交联剂将纳米材料与荧光染料形成复合物，从而使得荧光染料能够在纳米材料的带动下更快速地进入细胞，从而使得染色时间更短，染色效果好。
11.在其中一个实施例中，所述荧光染色剂的ph为7.4～7.6。
12.在其中一个实施例中，将所述混合液在30℃～60℃条件下反应4h以上而获得的反应液为荧光染色剂的浓缩液时，还包括采用所述c剂将所述荧光染色剂的浓缩液稀释为1
×
荧光染色剂的步骤。
13.在其中一个实施例中，所述荧光染料的激光波长为460nm～500nm，所述荧光染料的发射波长为500～530nm。
14.在其中一个实施例中，所述荧光染料包括sybrgreeni、sybrgreenii、吖啶橙、碘化丙啶、碘化丙啶衍生物、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酸亚胺脂、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酸亚胺脂衍生物、hoechst、hoechst衍生物、4,6-二脒基-2-二苯基吲哚、4,6-二脒基-2-二苯基
吲哚衍生物和c
28h28
n2o3s2中的至少一种。
15.在其中一个实施例中，所述交联剂包括碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的至少一种。
16.在其中一个实施例中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、tris缓冲液和hepes缓冲液中的一种。
17.在其中一个实施例中，所述c剂还包括防腐剂。
18.一种荧光染色剂，由上述的荧光染色剂的制备方法制得。
19.一种荧光染色剂，包括：
20.a剂，所述a剂包括纳米材料，所述纳米材料包括纳米四氧化三铁和纳米二氧化硅中的至少一种；
21.b剂，所述b剂包括能够与核酸结合的荧光染料；及
22.c剂，所述c剂包括1％(m/v)～20％(m/v)的甘油、0.1％(m/v)～5％(m/v)的二甲基亚砜和缓冲液。
23.一种染色方法，包括以下步骤：
24.采用固定剂将样本固定之后，晾干；及
25.向晾干后的所述样本上滴加染色剂进行染色，所述染色剂的原料为上述的荧光染色剂的制备方法制得荧光染色剂。
26.在其中一个实施例中，固定剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙醛中的至少一种。
附图说明
27.图1为实施例1的荧光染色剂的染色结果；
28.图2为实施例2的荧光染色剂的染色结果；
29.图3为实施例3的荧光染色剂的染色结果；
30.图4为实施例4的荧光染色剂的染色结果；
31.图5为实施例5的荧光染色剂的染色结果；
32.图6为实施例6的荧光染色剂的染色结果。
具体实施方式
33.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
34.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。需要说明的是，在本文中“10
×
荧光染色剂”是指10倍浓度的荧光染色剂，需要稀释10倍后使用；“5
×
荧光染色剂”指5倍浓度的荧光染色剂，需要稀释5倍后使用；“1
×
荧光染色剂”指荧光染色剂的使用浓度，直接使用。
35.本技术一实施方式提供了一种荧光染色剂的制备方法，该制备方法步骤s10和步骤s20。具体地：
36.步骤s10：将a剂、b剂、交联剂和c剂混合，制备混合液。
37.a剂包括纳米材料，纳米材料包括纳米四氧化三铁和纳米二氧化硅中的至少一种。b剂包括能够与核酸结合的荧光染料。纳米材料容易被细胞吸收，纳米材料与能够与核酸结合的荧光染料通过交联剂作用之后形成复合物，在纳米材料的协助下，荧光染料能够更快地到达细胞内，从而更快地与核酸结合而实现染色。需要说明的是，本文的“核酸”包括dna和rna中的至少一种。
38.在一些实施例中，纳米材料的平均直径为1nm～100nm。在一个可选地具体示例中，纳米材料的平均直径为5nm、10nm、30nm、50nm或80nm。进一步地，纳米材料的平均直径为5nm～70nm。更进一步地，纳米材料的平均直径为5nm～10nm。
39.在一些实施例中，纳米材料的粒径范围为1nm～100nm。进一步地，纳米材料的粒径范围为5nm～70nm。
40.在一个可选地具体示例中，a剂为纳米材料的溶液。
41.在一些实施例中，b剂中的荧光染料的激光波长为460nm～500nm，荧光染料的发射波长为500～530nm。
42.在一些实施例中，荧光染料包括sybr green i、sybr green ii、吖啶橙、碘化丙啶、碘化丙啶衍生物、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酸亚胺脂、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酸亚胺脂衍生物、hoechst、hoechst衍生物、4,6-二脒基-2-二苯基吲哚、4,6-二脒基-2-二苯基吲哚衍生物和c
28h28
n2o3s2((z)-4-((3-methyl-benzo[d]thiazol-2(3h)-ylidene)methyl)-1-propylquinolin-1-ium4-methylbenzenesulfonate)中的至少一种。
[0043]
交联剂用于将纳米材料和荧光染料形成复合物。在一些实施例中，交联剂包括碳二亚胺(edc或edac)、二环己基碳二亚胺(dcc)、二异丙基碳二亚胺和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的至少一种。
[0044]
c剂包括1％(m/v)～20％(m/v)的甘油、0.1％(m/v)～5％(m/v)的二甲基亚砜和缓冲液。在一些实施例中，缓冲液包括磷酸盐缓冲液、tris缓冲液和hepes缓冲液中的一种。进一步地，c剂包括1％(m/v)～10％(m/v)的甘油、0.5％(m/v)～3％(m/v)的二甲基亚砜和磷酸盐缓冲液。更进一步地，c剂包括1％(m/v)～5％(m/v)的甘油、0.5％(m/v)～2％(m/v)的二甲基亚砜和5mm～50mm磷酸盐缓冲液。
[0045]
在一些实施例中，c剂还包括防腐剂。在一个可选地具体示例中，防腐剂为proclin 300。可以理解的是，在其他实施例中，防腐剂不限于proclin 300，还可以是其他物质。
[0046]
以制备10
×
荧光染色剂计，纳米材料在混合液中的浓度为0.05％(m/v)～0.1％(m/v)，荧光染料在混合液中的浓度为1％(m/v)～50％(m/v)，交联剂在混合液中的浓度为0.5％～50％。进一步地，以制备10
×
荧光染色剂计，纳米材料在混合液中的浓度为0.05％(m/v)～0.09％(m/v)，荧光染料在混合液中的浓度为1％(m/v)～15％(m/v)，交联剂在混合液中的浓度为1％～15％。更进一步地，以制备10
×
荧光染色剂计，纳米材料在混合液中的浓度为0.06％(m/v)～0.09％(m/v)，荧光染料在混合液中的浓度为5％(m/v)～10％(m/v)，交联剂在混合液中的浓度为2％～8％。
[0047]
在一些实施例中，染料为多种，以制备10
×
荧光染色剂计，每种荧光染料在混合液中的浓度为1％(m/v)～50％(m/v)。进一步地，染料为多种，以制备10
×
荧光染色剂计，每种荧光染料在混合液中的浓度为1％(m/v)～15％(m/v)。更进一步地，染料为多种，以制备10
×
荧光染色剂计，每种荧光染料在混合液中的浓度为5％(m/v)～10％(m/v)。
[0048]
在一些实施例中，制备混合液的步骤包括：将a剂和交联剂与c剂混合，制备ac混合液；及将b剂加入ac混合液中，制备混合液。在另一些实施例中，将b剂和交联剂与c剂混合，制备bc混合液；及将a剂加入bc混合液中，制备混合液。
[0049]
步骤s20：将混合液在30℃～60℃条件下反应4h以上，制备荧光染色剂。
[0050]
在一些实施例中，步骤s20中的反应温度为35℃～55℃，反应的间为6h～24h。在一个可选地具体示例中，步骤s20中的反应的时间为35℃、40℃、45℃或50℃；步骤s20中的反应的时间为8h、12h、15h或20h。进一步地，步骤s20中的反应温度为45℃～55℃，反应的时间为10h～15h。
[0051]
在一些实施例中，在混合液在30℃～60℃的水浴条件下反应结束后，还包括调节ph的步骤。荧光染色剂的ph为7.4～7.6。
[0052]
可以理解的是，在一些实施例中，将混合液在30℃～60℃条件下反应4h以上所得的反应液为荧光染色剂的浓缩液，也即是此反应结束而获得的荧光染色剂为非1
×
荧光染色剂(例如2
×
、5
×
或10
×
)。此时，可以将混合液在30℃～60℃条件下反应4h以上所得的反应液(即荧光染色剂的浓缩液)作为上述制备方法的终产物。如此设置，可以使得制得的荧光染色剂便于储存和运输。当然，在使用时还包括采用c剂将荧光染色剂的浓缩液稀释为1
×
荧光染色剂的步骤。可以理解的是，在另一些实施例中，还可以将混合液在30℃～60℃条件下反应4h以上所得的反应液((即荧光染色剂的浓缩液))稀释，从而得到1
×
荧光染色剂。如此设置，在使用时，不必稀释，直接使用即可。
[0053]
例如，在一些实施例中，按照10
×
荧光染色剂称取a剂、b剂和交联剂的量，然后与c剂混合后在30℃～60℃条件下反应4h以上，从而制备10
×
荧光染色剂。在使用时，将10
×
荧光染色剂与c剂按照1：9的体积比混合，从而制得1
×
荧光染色剂供染色使用。
[0054]
此外，本技术一实施方式还提供了一种荧光染色剂，该荧光染色剂由上述任一实施例的荧光染色剂的制备方法制得。此类荧光染色剂不必进行加热反应后再使用，可以直接使用或稀释之后使用。
[0055]
另外，本技术另一实施方式还提供了另一种荧光染色剂，该荧光染色剂包括：a剂、b剂、交联剂和c剂，a剂包括纳米材料，纳米材料包括纳米四氧化三铁和纳米二氧化硅中的至少一种；b剂包括能够与核酸结合的荧光染料，c剂包括1％(m/v)～20％(m/v)的甘油、0.1％(m/v)～5％(m/v)的二甲基亚砜和缓冲液。更具体地，a剂、b剂、交联剂和c剂的组成和用量如上文所述，此处不再赘述。此类荧光染色剂在使用时，需要将a剂、b剂、交联剂和c剂混合，制备混合液，然后将该混合液在30℃～60℃条件下反应4h以上，制成用于使用的荧光染色剂。
[0056]
在一些实施例中，a剂、b剂、交联剂和c剂分别单独包装。在另一些实施例中，交联剂单包装，a剂、b剂和c剂一起包装。在另一些实施例中，交联剂和c剂分别单独包装，a剂和b剂混合后一起包装。在另一些实施例中，a剂、b剂、交联剂和c剂混合后一起包装。
[0057]
另外，本技术一实施方式还提供了一种染色方法，该染色方法包括步骤s100和步骤s200。具体地：
[0058]
步骤s100：采用固定剂将样本固定之后，晾干。
[0059]
在细胞被固定后，细胞膜上的孔的孔径会变大，更容易让纳米材料与染料形成的复合物进入细胞内。在一些实施例中，固定剂包括甲醇、乙醇、丙酮和乙醛中的至少一种。在
一个可选地具体实施例中，固定剂为无水甲醇。
[0060]
在一些实施例中，样本为阴道分泌物样本。采用固定剂将样本固定的操作包括：将样本浸没在固定剂中，固定时间为1min～30min。进一步地，固定时间为2min～15min。
[0061]
当然，在采用固定剂将样本固定之前，还包括将样本进行涂片并晾干的步骤。进一步地，在固定剂处理前的晾干为自然晾干。
[0062]
步骤s200：向晾干后的样本上滴加染色剂进行染色。
[0063]
具体地，染色剂的原料为上述任一实施例的荧光染色剂的制备方法制得的荧光染色剂。在一些实施例中，上述荧光染色剂的制备方法制得的荧光染色剂为1
×
荧光染色剂。此时，直接将上述荧光染色剂的制备方法制得的荧光染色剂滴加在晾干后的样本上进行染色。在另一些实施例中，上述荧光染色剂的制备方法制得的荧光染色剂为荧光染色剂的浓缩液，此时，先将上述荧光染色剂的制备方法制得的荧光染色剂采用c剂稀释为1
×
荧光染色剂，然后将1
×
荧光染色剂滴加在晾干后的样本上进行染色。
[0064]
在一些实施例中，染色的时间为10s～30s。在一个可选地具体实施例中，染色的时间为10s、15s、20s、25s或30s。
[0065]
可以理解的是，在染色结束后，还包括采用水清洗染色后的样本的步骤。当然，在清洗染色后的样本之后，还包括将样本上的水甩干或自然晾干的步骤。
[0066]
上述染色方法，采用上述任一实施例的荧光染色剂的制备方法制得的荧光染色剂作为染色剂的原料，从而使得上述染色方法染色速度快且染色效果好。
[0067]
具体实施例
[0068]
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。本文中的“dmso”均是指二甲基亚砜；“mm”是指mmol/l。
[0069]
实施例1
[0070]
1.c剂的配制：按1l配制量计算，按顺序将一定量的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甘油、dmso、proclin 300投料到1l反应器中，加蒸馏水定容到1l，充分搅拌使所有物料都完全溶解。最终溶液(c剂)的物料浓度如下：pbs 50mm、甘油1％(m/v)、dmso 0.5％(m/v)、proclin 300 0.5％(m/v)。用1.0m hcl进行ph值调节，使成分c剂ph值为5.00。4℃保存备用。
[0071]
2.染色剂的配制：
[0072]
(1)将a剂(a剂是纳米二氧化硅溶液，纳米二氧化硅的平均直径为7nm)用c剂稀释，并加入交联剂碳二亚胺(edac)，使纳米二氧化硅的浓度为0.08％(m/v)，edac的浓度为0.5％(m/v)，制得ac混合液。然后将吖啶橙加入ac混合溶液中，使吖啶橙浓度为8％(m/v)，然后50℃水浴反应12小时，得到10
×
荧光染色剂。
[0073]
(2)将上述步骤(1)制得的10
×
荧光染色剂与c剂按1：9体积比混合，用0.1m盐酸调整ph到7.5，制得本实施例的荧光染色剂。
[0074]
实施例2
[0075]
本实施例的荧光染色剂的制备方法与实施例1大致相同，其不同在于，本实施例的荧光染色剂的制备原料不含纳米二氧化硅溶液。本实施例的荧光染色剂的制备方法包括：
将吖啶橙采用c剂稀释，使得c
28h28
n2o3s2的浓度为0.8％(m/v)，并用0.1m盐酸调整ph到7.5，得到本实施例的荧光染色剂。
[0076]
实施例3
[0077]
1.c剂的配制：与实施例1相同。
[0078]
2.染色剂的配制：
[0079]
(1)将a剂(a剂是纳米四氧化三铁溶液，纳米四氧化三铁的平均直径为7nm)用c剂稀释，并加入交联剂碳二亚胺(edac)，使纳米四氧化三铁的浓度为0.08％(m/v)，edac的浓度为0.5％(m/v)，制得ac混合液。然后将sybrgreen i加入ac混合溶液中，使sybrgreen i浓度为1％(m/v)，然后50℃水浴反应12小时，得到10
×
荧光染色剂。
[0080]
(2)将上述步骤(1)制得的10
×
荧光染色剂与c剂按1：9体积比混合，用0.1m盐酸调整ph到7.5，制得本实施例的荧光染色剂。
[0081]
实施例4
[0082]
本实施例的荧光染色剂的制备方法与实施例3大致相同，其不同在于，本实施例的荧光染色剂的制备原料不含纳米四氧化三铁溶液。本实施例的荧光染色剂的制备方法包括：将sybrgreen i采用c剂稀释，使得sybrgreen i的浓度为0.1％(m/v)，并用0.1m盐酸调整ph到7.5，得到本实施例的荧光染色剂。
[0083]
实施例5
[0084]
1.c剂的配制：与实施例1相同。
[0085]
2.染色剂的配制：与实施例1大致相同，其不同点在于，在本实施例的荧光染色剂的制备过程中，纳米二氧化硅的用量与实施例1不同。具体地，本实施例的染色剂的制备步骤包括：
[0086]
(1)将a剂(a剂是纳米二氧化硅溶液，纳米二氧化硅的平均直径为7nm)用c剂稀释，并加入交联剂碳二亚胺(edac)，使纳米二氧化硅的浓度为0.1％(m/v)，edac的浓度为15％(m/v)，制得ac混合液。然后将吖啶橙加入ac混合溶液中，使吖啶橙浓度为50％(m/v)，然后50℃水浴反应12小时，得到10
×
荧光染色剂。
[0087]
(2)将上述步骤(1)制得的10
×
荧光染色剂与c剂按1：9体积比混合，用0.1m盐酸调整ph到7.5，制得本实施例的荧光染色剂。
[0088]
实施例6
[0089]
1.c剂的配制：与实施例1相同。
[0090]
2.染色剂的配制：与实施例1大致相同，其不同点在于，本实施例的荧光染色剂的制备过程中，纳米二氧化硅的用量与实施例1不同。具体地，本实施例的染色剂的制备步骤包括：
[0091]
(1)将a剂(a剂是纳米二氧化硅溶液，纳米二氧化硅的平均直径为7nm)用c剂稀释，并加入交联剂碳二亚胺(edac)，使纳米二氧化硅的浓度为0.1％(m/v)，edac的浓度为5％(m/v)，制得ac混合液。然后将吖啶橙加入ac混合溶液中，使吖啶橙浓度为15％(m/v)，然后50℃水浴反应12小时，得到10
×
荧光染色剂。
[0092]
(2)将上述步骤(1)制得的10
×
荧光染色剂与c剂按1：9体积比混合，用0.1m盐酸调整ph到7.5，制得本实施例的荧光染色剂。
[0093]
测试
[0094]
采用实施例1～实施例6制得的荧光染色剂对阴道分泌物进行染色，以检验各个实施例的荧光染色剂的染色效果。采用各实施例的荧光染色剂分别进行染色的步骤包括：
[0095]
(1)阴道分泌物样本制片：用拭子将样本均匀涂抹于玻片中央圆环中，涂层要薄。
[0096]
(2)自然晾干。
[0097]
(3)浸没于无水甲醇中固定2min。
[0098]
(4)自然晾干。
[0099]
(5)根据不同染色时间滴加染色液进行染色；实施例1的荧光染色剂的染色时间为10s、20s和30s；实施例2的荧光染色剂的染色时间为20s、40s和60s；实施例3的荧光染色剂的染色时间为10s、20s和30s；实施例4的荧光染色剂的染色时间为20s、40s和60s；实施例5的荧光染色剂的染色时间为10s、20s和30s；实施例6的荧光染色剂的染色时间为10s、20s和30s。
[0100]
(6)用水冲洗，甩干。
[0101]
(7)荧光显微镜下观察并用配套软件进行图片拍摄，并做好名称记录。
[0102]
各实施例的染色结果如图1～图6所示，其中：图1～图6均是荧光显微镜40倍的条件下拍摄的图像；图1为实施例1的荧光染色剂的染色结果，图2为实施例2的荧光染色剂的染色结果，图3为实施例3的荧光染色剂的染色结果，图4为实施例4的荧光染色剂的染色结果，图5为实施例5的荧光染色剂的染色结果，图6为实施例6的荧光染色剂的染色结果。需要说明的是，实施例1、实施例2、实施例5和实施例6的阴道分泌物来自同一临床样本，实施例3和实施例4的阴道分泌物来自另一个临床样本。
[0103]
由图1和图3可知，采用实施例1和实施例3的荧光染色剂进行染色时，在染色时间为20s时就可以有高质量的荧光成像图。经实施例1和实施例3的荧光染色剂染色20s之后，上皮细胞呈黄绿色、细菌呈红色。
[0104]
由图2和图4可知，采用实施例2和实施例4的荧光染色剂染色40s～60s时，染色效果较好。经实施例2和实施例4的荧光染色剂染色40s～60s后，上皮细胞呈黄绿色、细菌呈红色。并且与采用添加有纳米材料的实施例1和实施例3的荧光染色剂相比，没有添加纳米材料的实施例2和实施例4的荧光染色剂染色后的样本的颜色较暗；并且实施例1的荧光染色剂的染色效果比实施例3的荧光染色剂的染色效果更佳。
[0105]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0106]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。