一种冠心舒通胶囊抗心肌缺血的生物标志物的辨识方法与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一组评价药物制剂质量或药效学的生物标志物及其检测方法


背景技术：

2.中药复方制剂是在中医药理论指导下，以中医方剂为基础，中药材为原料，通过提取、分离、纯化制成直接供临床使用的各种复方制剂。中药复方制剂作为中医药产业发展中的重要代表，已成为中药现代化发展不可或缺的一部分。针对中药复方制剂种类繁多、成分复杂、作用机理不明确等问题，中药研究者们已经进行大量基础研究并获得了不错的成就。从传统的单一指标检测发展到多指标，从外观形态鉴别发展到整体质量评价，包括指纹图谱的发展、“一测多评”方法的应用、中药质量标志物的提出，都为中药复方制剂的质量评价带来了新思路。
3.冠心舒通胶囊是心血管系统疾病常用的中药复方制剂，批准文号：国药准字z20020055，由陕西步长制药有限公司生产，其主要成分由广枣、丹参、丁香、冰片、天竺黄组成，具有活血化瘀，通经活络，行气止痛的功效。临床主要用于胸痹、心血瘀阻证，症见胸痛、胸闷、心慌、气短；冠心病、心绞痛见上述症候者。不良反应为个别患者用药后出现恶心、胃部不适、胃中嘈杂不安等胃肠道反应。
4.目前，2020版中国药典一部对于冠心舒通胶囊的质量控制如下：冰片、丁香照气相色谱法(通则0521)测定，丹参酮ⅱa、丹酚酸b照高效液相色谱法(通则0512)测定。申请号为200510124510.0的发明专利公开了：一种用于治疗冠心病、心绞痛的中药胶囊剂及其制法和质量控制方法，其中对冠心舒通胶囊的质量控制分为鉴别与含量测定，鉴别方面，对丹参、丁香、冰片采用薄层色谱法鉴别；含量测定方面，因冰片具有挥发性，易升华，故采用气相色谱法对冰片进行含量测定，采用高效液相色谱法对丹参酮ⅱa、丹酚酸b进行含量测定。申请号为201410003476.0的发明专利公开了一种治疗冠心病的中药制剂的指纹图谱测定方法，该中药指纹图谱建立了包括没食子酸、丹参素钠、原儿茶酸等有效成分在内的30个特征峰，能有效控制冠心舒通胶囊的产品质量。可见，现有技术已有报道采用分析化学的方法对冠心舒通胶囊进行质量控制，但如何通过生物学手段对冠心舒通胶囊进行质量控制，现有技术罕有报道。此外，现有技术未提供生物学手段来评价中药复方制剂与机体作用时的生物效应，也未提供心血管疾病患者在服用冠心舒通后，如何通过生物学手段观察其治疗情况。
5.蛋白质组学作为一门新兴学科，可以从整体水平研究蛋白组成及生物学功能，不仅可以得知发挥作用的蛋白质的身份，而且还可以通过测定蛋白质的浓度了解其在细胞水平的生物学功能。在心血管疾病的研究领域，蛋白质组学主要用于研究鉴定影响心血管疾病的病理生理机制和发展过程，涉及心脏发育先天性缺损，动脉粥样硬化，高血压，心肌炎，心肌病，心肌梗死，心律失常，心力衰竭，动脉瘤等。在过去的十年中，蛋白质组学技术得以迅猛发展，包括样品准备，质谱分析，数据库搜索以及生物信息学技术等，为心血管疾病研
究提供一整套客观的蛋白质分析，对心血管领域疾病机制研究级临床药物研发做出了重大的贡献。
6.本研究采用目前最新的，功能最为强大的tmt蛋白质组学技术鉴定及筛选与心肌缺血相关的差异表达蛋白。tmt(tandemmasstags)是由赛默公司开发的一种体外标记技术，广泛用于差异表达蛋白质分析研究中。该技术采用6重或10重同位素标签，与肽段的氨基发生共价结合反应，可实现同时对6个/10个不同样品中蛋白质的定性和定量分析。
7.与之前的itraq技术相比具有(1)通量高：一可一次实现最多10次样品的分离分析；(2)重复朝且定量准确：所有样品的分离鉴定条件完全一致，保证了实验重复性，同时增强定量的准确性。(3)分辨率高：可与最高分辨率的lc-ms技术结合，实现对低丰度蛋白的定性定量。(4)数据丰富：可以获得检测到的所有蛋白的定性和定量信息。(5)自动化程度高：以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快的优点。但目前尚未有通过tmt定量蛋白组学分析冠心舒通胶囊抗心肌缺血相关的生物标志物的报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一组评价药物制剂质量或药效学的生物标志物，以解决上述现有技术中存在的问题，为抗心脑血管类疾病药物的质量控制和药效学研究提供有用的工具。
9.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
10.一组评价药物制剂质量或药效学的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物为alb、ndufa8、saa、dock7、hist1h1c、tf、cfb、dnajc11、itih1、ltf、cox6b1、itih2、mt1m、golga3、mcee、sacs、pabpc5、loc297568、mroh6、ctrb1、c3、amy2、prss1、mtnd3、a2m、hp、b2m、mt-atp8、sparc、ahsg、cycs、ptk2b、cep162、tnnc1、slc39a8、serpinc1、arhgdia、a1m、ambp、krt16、ppard、timm9、txnrd2蛋白中的一种或多种。
11.本发明所述的alb为白蛋白、ndufa8为泛素氧化还原酶亚基a8、saa为血清淀粉样蛋白a簇、dock7为有丝分裂细胞因子7、hist1h1c为组蛋白集群1、tf为转铁蛋白、cfb为补体因子b、dnajc11为热休克蛋白家族成员c11、itih1为α-胰蛋白酶间抑制剂重链1、ltf为乳运铁蛋白、cox6b1为细胞色素c氧化酶亚基6b1、itih2为α-胰蛋白酶间抑制剂重链2、mt1m为金属硫蛋白1m、golga3为高尔基体蛋白a3、mcee为甲基丙二酰辅酶a表异构酶、sacs为囊蛋白分子伴侣、pabpc5为聚为a结合蛋白5、loc297568为α1抑制剂iii、mroh6为重组蛋白6、ctrb1为胰凝乳蛋白酶原b1、c3为补体c3、amy2为α淀粉酶2、prss1为丝氨酸蛋白酶1、mtnd3为nadh-泛素氧化还原酶链3、a2m为α2巨球蛋白、hp为结合珠蛋白、b2m为β2微球蛋白、mt-atp8为atp合酶蛋白8、sparc为基底膜蛋白40、ahsg为α2-hs糖蛋白、cycs为细胞色素c、ptk2b为蛋白酪氨酸激酶2、cep162为中心体蛋白162、tnnc1为慢性肌钙蛋白c、slc39a8为锌转运蛋白、serpinc1为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族c成员1、arhgdia为rhogdp-解离抑制因子1、a1m为α1巨球蛋白、ambp为α1微球蛋白、krt16为角蛋白16、ppard为过氧化物酶体增殖活化受体、timm9为线粒体内膜9、txnrd2为硫氧还蛋白还原酶2。
12.优选的，生物标志物在制备诊断或治疗心律失常、高血压、动脉粥样硬化、心肌梗塞、肺栓塞、充血性心力衰竭、心肌缺血、冠心病、缺血性脑损伤、脑卒中的制剂中的应用。
13.优选的，所述的生物标志物在制备诊断或治疗心肌缺血制剂中的应用。
14.优选的，其中ndufa8、hist1h1c、pabpc5、mt-atp8、cox6b1、cycs、timm9、txnrd2蛋白表达水平上调。
15.优选的，生物标志物在制备评价心血管系统疾病药物质量的试剂中的应用。
16.优选的，的生物标志物在构建预测心肌缺血的计算模型中的应用。
17.优选的，所述生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：
18.(1)、心肌细胞缺氧或复氧模型的建立；
19.(2)、取空白组普通大鼠心肌细胞、模型组未注射给药的大鼠心肌细胞，给药组注射给药的大鼠心肌细胞，进行蛋白提取；
20.(3)、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；
21.(4)、胰蛋白酶酶解；
22.(5)、tmt标记；
23.(6)、反相色谱分离及液相色谱、质谱连用分析；
24.(7)、步骤(6)获得的数据采用proteome discover2.4分析；
25.(8)、生物学信息分析。
26.优选的，所述步骤(6)反相色谱的色谱条件为：agilent 1100hplc，色谱柱为agilent zorbax extend-c18窄径柱(2.1x150mm,5pm)；
27.检测波长：紫外210nm和280nm；流动相a相：acn-h2o(2﹕98)；流动相b相：acn-h2o(90﹕10)；流速：300μl/min；
28.梯度洗脱条件：
29.0～8min,98％a；8-8.01min,98％～95％a；8.01-48min,95％～75％a；48-60min,75-60％a；60-60.01min,60-10％a；60.01-70min,10％a；70-70.01min,10-98％a；70.01-75min,98％a。
30.优选的，所述生物标志物的筛选方法，所述液相色谱、质谱连用分析为将样品以300nl/min的流速上样到预柱用acxlaim pepmap 100 100um
×
2cm(rp-c18,thermo fisher)，再经分析柱acxlaim pepmap rslc,75um
×
15cm(rp-c18,thermo fisher)分离。流动相a相：h2o-fa(99.9﹕0.1)；流动相b相：acn-h2o-fa(80:19.9:0.1)；
31.梯度洗脱条件：
32.0-1min,2-9％b；1-45min,9-29％b；45-52min,29-37％b；52-56min,37-100％b；56-60min,100％b；
33.一级ms质量分辨率设为60000，自动增益控制值设为3e6，最大注射时间为50ms；质谱扫描设定为全扫描荷质比m/z范围350-1500，并对其中10个最高峰进行ms/ms扫描；所有ms/ms图谱采集使用数据依赖型的正离子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量设为32；ms/ms的分辨率设为15000；自动增益控制设为2e5，离子最大累积时间为40ms；动态排除时间设为30s。
34.优选的，所述生物学信息分析为通过药效学数据和潜在生物标志物含量进行相关性分析，根据模型变量重要性因子vip值，筛选得到对模型有显著贡献vip》1的与药效相关的生物标志物；通过与候选生物标志物网络进行蛋白互作网络(ppi)分析，对最终确定的生物标志物进行功能注释，进而确定与药物药效功能相关的生物标志物。
35.本发明具有如下有益的技术效果：
36.(1)、本发明采用tmt蛋白质组学技术完成了冠心舒通胶囊抗心肌缺血作用的蛋白质的鉴定及筛选，共鉴定了3459个蛋白，筛选了急性心肌梗死后表达显著变化的1026个差异蛋白，并通过聚类分析、相关性分析以及veen分析，得出高、中、低三个剂量给药组与模型组相比，共计有43个相同的差异蛋白，这43个差异蛋白可以作为部分潜在抗心肌缺血候选生物标志物。
37.(2)、在本发明筛选的差异蛋白中可能与免疫、炎症、蛋白运输、糖代谢、羧酸代谢、细胞骨架、细胞凋亡、细胞内环境稳态、离子平衡、肌动蛋白调控等相关。筛选的差异蛋白中，可以发现ndufa8、hist1h1c、pabpc5、mt-atp8、cox6b1(细胞色素氧化酶6b)、cycs(细胞色素c)、timm9(线粒体内膜9同源物(酵母)转位酶)、txnrd2(硫氧还蛋白还原酶2)等8个蛋白上调，这些上调蛋白均参与生物氧化的过程，为后续对其进行go通路及kegg生物学信息分析提供一定的理论基础，为进一步研究冠心舒通胶囊抗心肌缺血的具体机制、确定生物标志物奠定一定的基础。
38.(3)、通过本发明不仅可以评价中药复方制剂与机体作用时的生物效应，间接反映药物的有效性和安全性，为现行中药质量评价体系提供有效的补充，也可为临床精准医学的实施提供有力的工具。
附图说明
39.图1为本发明实施例的辨识流程图。
40.图2为本发明的标记定量蛋白组学实验流程图。
41.图3为本发明实施例的蛋白定量标准曲线。
42.图4为本发明实施例的蛋白样品浓度曲线。
43.图5为本发明实施例的样品sds-page电泳图。
44.图6为本发明实施例的质谱数据结果基本统计图。
45.图7为本发明实施例的冠心舒通胶囊抗心肌缺血差异蛋白统计图。
46.图8为本发明实施例的冠心舒通胶囊抗心肌缺血差异蛋白火山图(n＝3)；其中，a:高剂量组比模型组；b:中剂量组比模型组；c:低剂量组比模型组；d:模型组比空白组。
47.图9为本发明实施例的冠心舒通胶囊抗心肌缺血差异蛋白表达模式聚类热图(n＝3)，其中a:高剂量组比模型组；b:中剂量组比模型组；c:低剂量组比模型组；d:模型组比空白组。
48.图10为本发明实施例的冠心舒通胶囊抗心肌缺血差异蛋白表达相关性分析(n＝3)，其中a:高剂量组比模型组；b:中剂量组比模型组；c:低剂量组比模型组；d:模型组比空白组。
49.图11为本发明实施例的冠心舒通胶囊抗心肌缺血差异蛋白各组数据venn图(n＝3)，其中a:高、中、低剂量组与模型组相比的venn图；b:模型组与空白组比较以及高、中、低剂量组两两比较的venn图。
具体实施方式
50.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并
不用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
51.实施例1
52.(1)大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型的建立
53.取新生sd大鼠乳鼠，取其心脏，剪去心房，将心肌组织剪成约1mm3大小的碎块，分别加入0.25％胰酶溶液及0.016％ⅱ型胶原酶溶液各2.5ml，搅拌消化8次(1000r/min，37℃)，将各次离心所得的细胞沉淀合并，加含10％小牛血清的dmem培养液，制成悬液，计数后接种于6孔板，置于37℃培养箱中静置，自然沉降，1h后吸取细胞悬液，重复1次，吸取第2次细胞悬液，即得大鼠心肌细胞。将原代培养好的心肌细胞接种于96孔板中，每孔接种5
×
104个，再将96孔板移入三气培养箱中，缺氧20h，然后复氧4h，即得。
54.(2)基于tmt定量蛋白组学技术分析
55.实验分为空白正常心肌细胞组、缺氧复氧心肌细胞模型组和1mg
·
ml-1
、2mg
·
ml-1
和5mg
·
ml-1
不同给药剂量冠心舒通胶囊制剂给药组，细胞贴壁给药后采用三气培养箱进行缺氧复氧模型的构建，随后不同组别细胞均放置于三气培养箱缺氧20小时后再放置正常二氧化碳细胞培养箱复氧4小时，取出孔板，进行如下操作：
56.蛋白烷基化及酶切：对正常心肌细胞组、缺氧复氧心肌细胞模型组和1mg
·
ml-1
、2mg
·
ml-1
和5mg
·
ml-1
不同给药剂量组冠心舒通胶囊给药组细胞加入ripa细胞裂解液，进行蛋白抽提后随后再进行还原、烷基化、酶切等操作。
57.肽段标记：将tmt试剂分别加入到不同组别心肌组织蛋白样品中，将10个标记后的多肽样品混合，抽干备用；
58.scx分级：采用高ph值的反相色谱进行一维分离，进一步采用低ph值纳升液相色谱进行第二维分离。
59.质谱鉴定：lc-maldi靶上的肽片段采用赛默飞q exactive-hf质谱进行鉴定
60.质谱仪进行分析。
61.(3)生物信息学分析
62.通过药效学数据和潜在生物标志物含量进行相关性分析，根据模型变量重要性因子vip值，筛选得到对模型有显著贡献vip》1的与药效相关的生物标志物。通过与候选生物标志物网络进行ppi分析，对最终确定的生物标志物进行功能注释，进而确定与药物药效功能相关的生物标志物。
63.实施例2
64.如图1、2所示，以大鼠乳鼠心肌细胞为实验对象，进一步叙述：
65.仪器与试剂：
66.[0067][0068]
表2主要试剂
[0069][0070]
实验动物；
[0071]
spf级健康雄性sprague-dawley(sd)大鼠乳鼠，出生1～3d，均购于西安交通大学医学部实验动物中心(许可证号xjtu[陕]2011-0045)。
[0072]
实验流程；
[0073]
提取样品中总蛋白，取出一部分做蛋白浓度测定及sds-page检测，另取部分进行胰蛋白酶解及标记，然后取等量的各标记样品混合后进行色谱分离，最后对样品进行lc-ms/ms分析及数据分析。
[0074]
心肌细胞的原代培养；
[0075]
取6只新生sd大鼠乳鼠，用75％酒精棉球进行消毒，在无菌条件下开胸取出心脏。放入预冷的pbs中，清除血污，用镊子剔除周边血管组织及心房，保留心室，移入另一个装有预冷pbs液的培养皿中。用剪刀将其剪成约1mm3的组织块，随后置于250ml带盖塑料瓶中，加入胰酶混合消化液(0.25％的胰酶与0.016％的ⅱ型胶原酶各2.0ml)，放在磁力搅拌器上磁力消化(1000r/min，37℃)，第1次消化8min，弃掉消化液，第2次消化8min，剩余6次，每次消化约5min。每次消化液均过直径为70μm细胞筛网，所得滤液加入含10％胎牛血清的dmem终止消化，置于离心机中，以1000r/min离心10min，弃上清液，收集细胞沉淀，合并所得的细胞沉淀，加入含20％胎牛血清的dmem重悬，计数后接种于6孔板。将6孔板置于培养箱(37℃，5％co2)，静置2h，差速贴壁分离后，取上清即得心肌细胞。
[0076]
心肌细胞h/r模型的建立
[0077]
将原代培养好的心肌细胞接种于96孔板中，每孔接种5
×
104个，再将96孔板移入三气培养箱中，缺氧20h，然后正常培养箱复氧4h。
[0078]
蛋白提取
[0079]
将冷冻样品取出，同组混合后转移至1.5ml离心管中，转移至3kd超滤离心管中，4℃，6400
×
g离心40min，收集截留液，重复上一步骤直到样品全部用完，转移出截留液，用200μl色谱水冲洗超滤管3次，与截留液混合。将混合液4℃，12000
×
g离心15min，取上清。将上清放入冻干机，进行冷冻干燥，得到冻干粉后，加入100μl上清裂解液复溶，加入蛋白酶抑制剂pmsf使其终浓度为1mm,充分震荡混匀。将溶液在室温下12000
×
g离心10min,取上清至新的离心管，用bca试剂盒进行蛋白测定。
[0080]
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0081]
取每个样品10μg蛋白，采用12％sds-page进行分离,分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色，固定2h,染色12h,水洗至背景清晰,染色后的凝胶应用image scanner归描仪进行扫描，扫描模式为全彩模式，光密度值为300dpi。
[0082]
胰蛋白酶酶解
[0083]
根据测定的蛋白浓度，每个样品取50μg的蛋白，并用裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积，加入dtt使得dtt的终浓度为4.5mm,混匀，在55℃孵育30min，在冰上进行冷却直到达到室温，加入相应体积的碘乙酰胺，使得终浓度为9mm,充分混匀，室温避光放置15min。在以上溶液中加入6倍体积的丙酮沉淀蛋白，-20℃放置4h以上或者过夜。4℃,8000
×
g沉淀离心10min收集沉淀，挥发丙酮2-3min。加入100μlteab2复溶沉淀，加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶trypsin-tpck,并于37℃消化过夜，酶解后的样品冻干后于-80℃保存。
[0084]
tmt标记
[0085]
向冻干样品中加入33μl 200 mm teab缓冲液，涡流混匀，取出30μl样品于1.5mlep管中进行标记反应。从冰箱中取出tmt试剂，平衡到室温，加入88μl无水乙腈，涡流5min,离心。取41μl tmt试剂加到样品中，涡流混匀，室温放置1h。加入8μl羟胺终止反应15min，冻干后于-80℃保存。
[0086]
表3样品-标签对应表
[0087][0088]
反相色谱分离
[0089]
采用液相色谱：agilent1100 hplc，色谱柱为agilent zorbax extend-c18窄径柱(2.1x150mm,5μm)；检测波长：紫外210nm和280nm；流动相a相：acn-h2o(2﹕98,)；流动相b相：acn-h2o(90：10,)；流速：300μl/min；梯度洗脱条件：0～8min,98％a；8-8.01min,98％～95％a；8.01-48min,95％～75％a；48-60min,75-60％a；60-60.01min,60-10％a；60.01-70min,10％a；70-70.01min,10-98％a；70.01-75min,98％a。收集8-60min的样品，依次每隔1min收集洗脱液到1-15号离心管中，然后按照1到15号反复收样。收集好后真空冷冻干燥抽干，样品冷冻保存待上质谱。
[0090]
液相色谱-质谱连用分析
[0091]
样品以300nl/min的流速上样到预柱用acxlaim pepmap100 100um
×
2cm(rp-c18,thermofisher)，再经分析柱acxlaim pepmap rslc,75um
×
15cm(rp-c18,thermofisher)分离。流动相a相：h2o-fa(99.9﹕0.1)；流动相b相：acn-h2o-fa(80:19.9:0.1)；梯度洗脱条件0-1min,2-9％b；1-45min,9-29％b；45-52min,29-37％b；52-56min,37-100％b；56-60min,100％b。
[0092]
一级ms质量分辨率设为60000，自动增益控制值设为3e6，最大注射时间为50ms；质谱扫描设定为全扫描荷质比m/z范围350-1500，并对其中10个最高峰进行ms/ms扫描；所有ms/ms图谱采集使用数据依赖型的正离子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量设为32；ms/ms的分辨率设为15000；自动增益控制设为2e5，离子最大累积时间为40ms；动态排除时间设为30s。
[0093]
数据库检索
[0094]
数据采用proteome discover2.4分析。基本参数设置为；原始母离子质量容错率10ppm，次级片段的质量容错率为0.02da。半胱氨酸的烷基化为固定修饰，甲硫氨酸的氧化，蛋白n端的乙酰化为可变修饰。采用胰蛋白酶消化法，最大容忍漏切位点数设为2，肽段最小长度为7，最大修饰数为5.定量方法设置为tmt-10plex，蛋白质鉴定、psm鉴定的假阳性率都设置为1％。
[0095]
蛋白浓度测定结果
[0096]
表4标准品吸光度及浓度
[0097][0098]
以标准蛋白浓度为横坐标，od
562
为纵坐标制作标准曲线图，求出回归方程，即得标准曲线，见图3、4所示。
[0099]
待测样品的吸光度值见下表，计算其平均od
562
，代入上述回归方程，最后计算出待
测样品的测得浓度，测得浓度乘以稀释倍数即为样品的真实浓度。
[0100]
表5待测样品吸光度及浓度
[0101][0102]
sds-page结果
[0103]
sds-page测定结果如图5所示。分子量由上到下分别为:116,66.2,45,35,25,18.4,14.4(kda)，结论：蛋白条带分布均匀，且重复性好，可用于后续实验。
[0104]
蛋白鉴定结果
[0105]
通过对三组细胞蛋白进行质谱分析，第一组共得到445857张二级图谱，可利用图谱为28645，共鉴定到15025条肽段，共鉴定3254个蛋白；第二组共得到450656张二级图谱，可利用图谱为31012，共鉴定到16285条肽段，共鉴定3459个蛋白；第三组共得到447227张二级图谱，可利用图谱为29484，共鉴定到15369条肽段，共鉴定3292个蛋白。实验结果详细统计如下：(表6，图7)
[0106]
表6基本鉴定结果统计
[0107][0108]
差异蛋白筛选
[0109]
利用数据库检索得到原始数据后，按照score sequestht》0且unique peptide≥1，并去除空白值的标准筛选可信蛋白。在可信蛋白基础上，选取两个标准计算样品间的差异。其中foldchange用来评估某一蛋白在样品间的表达水平变化倍数；经t-test检验计算的p-value展现样品间差异的显著程度。差异筛选条件：foldchange＝1.5倍且p-value《0.05。
[0110]
差异蛋白表达水平的聚类分析
[0111]
基于不同分组的差异蛋白(或者不同差异倍数的差异蛋白)功能富集的聚类分析用于发明其在特定功能(go，kegg通路，蛋白结构域等)上存在的潜在联系和差异。首先收集所用蛋白分组富集到的功能分类信息和对应的功能富集p-value值，然后筛选出至少在一个蛋白分组中为显著富集(p《0.05)的功能分类。先对筛选得到的p-value数据矩阵进行以-log10的对数变换，然后对进行对数变换后的数据矩阵运用z变换。最后将z变换后得到的数据集使用分层聚类(欧式距离，平均连接聚类)方法做单边聚类分析。
[0112]
差异表达蛋白相关性分析
[0113]
采用pearson算法，计算差异蛋白间的关联性。pearson是一个介于-1和1之间的
值，用来描述两组线性的数据一同变化移动的趋势。
[0114]
当两个变量的线性关系增强时，相关系数趋于1或-1；当一个变量增大，另一个变量也增大时，表明它们之间是正相关的，相关系数大于0；如果一个变量增大，另一个变量却减小，表明它们之间是负相关的，相关系数小于0；如果相关系数等于0，表明它们之间不存在线性相关关系。相关系数越接近1，表明蛋白之间表达模式的相似度越高。
[0115]
venn分析
[0116]
针对两组及以上数据，通过venn分析各组中差异蛋白特性和共性。不同颜色代表不同组，图中数字分别表示交集的蛋白数以及每组特有的蛋白数。venn图对应的数据表格中，0表示在该组中不存在某蛋白，1表示该组中存在某蛋白。
[0117]
实验结果
[0118]
各分组差异表达蛋白情况
[0119]
本发明共分为7个比较组，包括high/hr、middle/hr、low/hr、hr/kb、high/middle、high/low、middle/low组。其中hr为模型组，kb为正常组，high、middle、low分别为高中低剂量组。如表7和图7所示，根据筛选条件，在hr/kb组共定量到473个表达上调蛋白，553个表达下调蛋白。在high/hr比较组中，共定量到74个表达上调蛋白，65个表达下调蛋白。middle/hr比较组中23个蛋白表达发生上调，39个蛋白表达发生下调。low/hr比较组中，15个上调表达蛋白，44个下调表达蛋白。high/middle组中，有12个上调表达蛋白，3个下调表达蛋白。high/low组中39个蛋白表达发生上调，13个蛋白表达发生下调。在middle/low3个蛋白表达发生上调，4个蛋白表达发生下调。
[0120]
表7冠心舒通胶囊抗心肌缺血差异蛋白统计表
[0121][0122]
为了清晰展示各组差异蛋白占总定量蛋白的比例，利用蛋白质差异表达倍数值(foldchange，fc)和差异显著性检验p-value将差异蛋白用不同颜色标示用以区分，即以log2(fc)为横坐标，以负对数-log10(p-value)为纵坐标制作火山图，如图8(a、b、c、d)所示：点越远表示差异越大。图中蓝色的点表示下调差异表达蛋白，红色的点为上调差异表达蛋白，灰色的点为非显著差异表达蛋白。
[0123]
差异蛋白表达水平聚类分析结果
[0124]
聚类热图可以用来进行标准化后的实验数据的质量控制和差异数据富集后的定制化数据展示。可以对数据和样品进行聚类，观测样品质量，也可以根据表达谱对共表达数据进行分组。基于r语言进行非监督层次聚类，一般同一类样品能通过聚类出现在同一簇中。从图中可以看出高中低剂量与模型组在不同的亚组中均有高表达和低表达的蛋白。差异比较组聚类分析热图9所示。红色表示高表达蛋白，蓝色表示低表达蛋白。每行表示每个蛋白在不同组中的表达量情况，每列表示每个组中所有差异蛋白的表达量情况。上方树形图表示对来自不同分组数据的聚类分析结果，左侧树状图表温寸来自不同组的不同蛋白麴居的聚类分析结果。
[0125]
差异表达蛋白相关性分析结果
[0126]
采用pearson算法，计算差异蛋白间的关联性，相关系数越接近1，表明蛋白之间表
达模式的相似度越高。具体结果如下图10为top50差异显著蛋白(pvalue排序)相关性分析图。图中红色为正相关，蓝色为负相关，颜色越深相关性越大。
[0127]
venn分析结果
[0128]
冠心舒通胶囊高、中、低剂量组与模型组相比的venn图以及模型组与空白组比较以及高、中、低剂量组两两比较的venn图如下图11所示。
[0129]
从图中可以看出高、中、低三个剂量给药组与模型组相比，共计有43个相同的差异蛋白，这43个差异蛋白可以作为部分潜在抗心肌缺血候选生物标志物。统计这43个差异蛋白的具体信息如下表8所示：
[0130]
表8 43个差异蛋白具体信息
[0131]
[0132][0133]
在本发明筛选的差异蛋白中可能与免疫、炎症、蛋白运输、糖代谢、羧酸代谢、细胞骨架、细胞凋亡、细胞内环境稳态、离子平衡、肌动蛋白调控等相关。从表中可以发现ndufa8(人重组蛋白)、hist1h1c(组蛋白1)、pabpc5(人源重组蛋白)、mt-atp8(atp合酶蛋白8)、cox6b1(细胞色素氧化酶6b)、cycs(细胞色素c)、tnnc1(慢性肌钙蛋白c)、timm9(线粒体内膜9同源物(酵母)转位酶)、txnrd2(硫氧还蛋白还原酶2)等9个蛋白上调，这些蛋白与细胞氧化过程密切相关，也可以发现一些近年来心血管领域关注的可能作为潜在生物标记物或者靶向干预的蛋白，如血清淀粉样蛋白a(saa)，α-2巨球蛋白(a2m)等。血清淀粉样蛋白a是由肝脏分泌的一种急性炎症反应蛋白，来自于载脂蛋白家族，可以与血浆高密度脂蛋白结合。发明表明，saa可以作为预测不良心血管事件的独立危险指标，在ami后3天显著升高。α-2巨球蛋白(a2m)也是近年来发现的具有潜在心肌梗死预测价值的生物分子，在一项260例急性心肌横死患者的发明中，纳入55名同时合并糖尿病的患者，发明结果显示a2m在糖尿病患者合并急性心肌梗死时水平明显上调。为后期进一步对其go通路富集分析以及kegg分析奠定基础。
[0134]
综上所述：
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蛋白质组学作为一门新兴学科，可以从整体水平发明蛋白组成及生物学功能，不仅仅可以得知发挥作用的蛋白质的身份，而且还可以通过测定蛋白质的浓度了解其在细胞水平的生物学功能。在心血管疾病的发明领域，蛋白质组学主要用于发明鉴定影响心血管疾病的病理生理机制和发展过程，涉及心脏发育先天性缺损，动脉粥样硬化，高血压，心肌炎，心肌病，心肌梗死，心律失常，心力衰竭，动脉瘤等。在过去的十年中，蛋白质组学技术得以迅猛发展，包括样品准备，质谱分析，数据库搜索以及生物信息学技术等，为心血管疾病发明提供一整套客观的蛋白质分析，对心血管领域疾病机制发明级临床药物研发做出了重大的贡献。
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本发明采用目前最新的功能最为强大的tmt蛋白质组学技术鉴定及筛选与心肌缺血相关的差异表达蛋白。tmt标记是由赛默公司开发的一种体外标记技术，广泛用于差异表达蛋白质分析发明中。该技术采用6重或10重同位素标签，与肽段的氨基发生共价结合反应，可实现同时对6个/10个不同样品中蛋白质的定性和定量分析。与之前的itraq技术相比具有：
[0137]
(1)通量高：一可一次实现最多10次样品的分离分析；(2)重复朝且定量准确：所有样品的分离鉴定条件完全一致，保证了实验重复性，同时增强定量的准确性。(3)分辨率高：可与最高分辨率的lc-ms技术结合，实现对低丰度蛋白的定性定量。(4)数据丰富：可以获得检测到的所有蛋白的定性和定量信息。(5)自动化程度高：以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快的优点。
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利用纳升级反相色谱-质谱进行蛋白质分析过程：在这一过程中需要进行组份合并，组分合并的原则为靠近梯度开始和终止的组份进行合并，梯度和时间的选择可能需要根据样品实际情况进行反复进行，以优化这一过程，本发明依照原则，按照实际情况进行了局部的调整，完成了优化。经过质谱分析所得到的的数据可以通过protein pilot软件对质谱结果进行搜库。可以根据样本的物种进行选择，鉴定标准为至少命中一条可信度95％的肽段的蛋白，按照蛋白定量＞2倍或者＜0.5倍，p＜0.05或p＜0.01的标准筛选差异蛋白。本发明为使其后生物信息学分析时数据更为宽泛，故选择p＜0.05的标准进行鉴定，鉴定出3459个蛋白。对于鉴定出的蛋白，需要通过生物信息学分析软件进行数据的分析处理，探寻发明需要的候选蛋白。
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本发明采用tmt蛋白质组学技术完成了冠心舒通胶囊抗心肌缺血作用的蛋白质的鉴定及筛选，共鉴定了3459个蛋白，筛选了急性心肌梗死后表达显著变化的1026个差异蛋白，并通过聚类分析、相关性分析以及veen分析，得出高、中、低三个剂量给药组与模型组相比，共计有43个相同的差异蛋白，这43个差异蛋白可以作为部分潜在抗心肌缺血候选生物标志物。在本发明筛选的差异蛋白中可能与免疫、炎症、蛋白运输、糖代谢、羧酸代谢、细胞骨架、细胞凋亡、细胞内环境稳态、离子平衡、肌动蛋白调控等相关。筛选的差异蛋白中，可以发现cox6b1(细胞色素氧化酶6b)、cycs(细胞色素c)、timm9(线粒体内膜9同源物(酵母)转位酶)、txnrd2(硫氧还蛋白还原酶2)等8个蛋白上调，这些上调蛋白均参与生物氧化的过程，为后续对其进行go通路及kegg生物学信息分析提供一定的理论基础，为进一步发明冠心舒通胶囊抗心肌缺血的具体机制、确定生物标志物奠定一定的基础。通过本发明不仅可以评价中药复方与机体作用时的生物效应，间接反映药物的有效性和安全性，为现行中药质量评价体系提供有效的补充，也可为临床精准医学的实施提供有力的工具。