一种微量样品中碳稳定同位素的测定方法

1.本发明涉及碳稳定同位素检测技术领域，尤其涉及一种微量样品中碳稳定同位素的测定方法。


背景技术：

2.线虫是土壤中数量最丰富的后生动物，其食性多样化使得各功能群从不同营养级影响土壤有机碳的形成和转化。植物寄生线虫通过与菌根真菌竞争养分或影响根际分泌物的质量调控微生物群落结构，进而对有机碳的积累和稳定产生强烈的影响。食微线虫(食真菌和食细菌线虫)主要通过与其各自相对应的微生物(真菌和细菌)驱动有机碳的积累和稳定。位于较高营养级的杂食/捕食线虫可以耦合来源于不同途径的碳流，并通过上行控制作用调控土壤有机碳形成和转化的进程。碳稳定同位素在微食物网的传递过程中会发生分馏，一般认为微生物在土壤有机碳的分解转化过程中起主导作用，但最近一些研究指出线虫的作用可能一直被低估了。利用碳稳定同位素研究线虫在碳循环中的作用是非常重要的研究手段。
3.传统的线虫体内固定的13c丰度的测定，是按照营养类群挑出五百至几千头线虫放入锡杯(8
×
5mm)中，锡杯烘干后用元素分析仪-同位素比率质谱仪联用(ea-irms)检测。但是该方法的缺点在于，样本量的下限受到ea中最小可接受氦流量和离子源泵可容纳的最大流速的限制，样本中的c元素会被分流掉，仅有不到1％的进入到质谱中进行检测。这就导致一位熟练的实验人员需要用一天或数天才能准备好一个线虫样品来满足c稳定同位素的检测条件。
4.因此，如何减少样本使用量，提高检测效率和精度，成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种微量样品中碳稳定同位素的测定方法，减少了测试所需的样品量，提高工作效率，节约人力物力。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种微量样品中碳稳定同位素的测定方法，包括如下步骤：
8.(1)将过硫酸钠、无水磷酸和水按照3.8～4.2g：0.9～1.1g：100ml的用量比混合，得到反应试剂；
9.(2)将样品和反应试剂在反应容器中混合，在反应容器中构建氦气环境，水浴后将样品中的碳元素氧化成二氧化碳；
10.(3)将水浴后的反应容器平衡10～14h，离心；
11.(4)采用gasbench-irms测定二氧化碳，进行δ13c分析。
12.作为优选，步骤(1)中所述水为煮沸的去离子水。
13.作为优选，步骤(2)中所述样品为线虫，所述线虫和反应试剂的用量比为45～55头：1ml。
14.作为优选，步骤(2)中所述反应容器为样品瓶。
15.作为优选，步骤(2)中所述构建氦气环境前将反应容器封盖；所述构建氦气环境的方法为：用80～120ml/min的氦气吹扫反应容器300～360s。
16.作为优选，步骤(2)中所述水浴的温度为90～100℃，所述水浴的时间为50～70min。
17.作为优选，步骤(3)中所述平衡的温度为23～27℃，所述离心的转速为2800～3200r/min，所述离心的时间为50～70s。
18.作为优选，步骤(4)中所述测定过程中gasbench ii样品盘的温度设定为23～27℃，色谱柱的温度设定为38～42℃，以流速为0.4～0.6ml/min的氦气作为载气，采用双孔采样针采集顶空二氧化碳，80～120μl定量环进样，经过色谱柱和干燥器后引入irms，进行δ13c分析。
19.作为优选，每个样品重复定量环进样8～12次。
20.本发明提供了一种微量样品中碳稳定同位素的测定方法，包括如下步骤：(1)将过硫酸钠、无水磷酸和水按照3.8～4.2g：0.9～1.1g：100ml的用量比混合，得到反应试剂；(2)将样品和反应试剂在反应容器中混合，在反应容器中构建氦气环境，水浴后将样品中的碳元素氧化成二氧化碳；(3)将水浴后的反应容器平衡10～14h，离心；(4)采用gasbench-irms测定二氧化碳，进行δ
13
c分析。本发明通过湿氧化法将微量线虫样品体内的碳氧化生成二氧化碳，采用gasbench-irms测定由微量线虫样品转化的二氧化碳气体，在保证测试精度和准确度基础上减少了测试所需的样品量5～10倍，大大提高工作效率，节约人力物力。
具体实施方式
21.本发明提供了一种微量样品中碳稳定同位素的测定方法，包括如下步骤：
22.(1)将过硫酸钠、无水磷酸和水按照3.8～4.2g：0.9～1.1g：100ml的用量比混合，得到反应试剂；
23.(2)将样品和反应试剂在反应容器中混合，在反应容器中构建氦气环境，水浴后将样品中的碳元素氧化成二氧化碳；
24.(3)将水浴后的反应容器平衡10～14h，离心；
25.(4)采用gasbench-irms测定二氧化碳，进行δ13c分析。
26.在本发明中，步骤(1)中所述硫酸钠、无水磷酸和水的用量比优选为4g：1g：100ml。
27.在本发明中，步骤(1)中所述水优选为煮沸的去离子水。
28.在本发明中，步骤(2)中所述样品优选为线虫，所述线虫和反应试剂的用量比优选为45～55头：1ml，进一步优选为50头：1ml。
29.在本发明中，步骤(2)中所述反应容器优选为样品瓶，进一步优选为高温灭菌处理后的12ml labco样品瓶。
30.在本发明中，步骤(2)中所述构建氦气环境前优选将反应容器封盖，所述构建氦气环境的方法优选为：用80～120ml/min的氦气吹扫反应容器300～360s，进一步优选为用100ml/min的氦气吹扫反应容器330s。
31.在本发明中，构建氦气环境一是为了将氧气排出，二是将反应前气体中二氧化碳排出，三是同位素检测只能用氦气作为载气。
32.在本发明中，步骤(2)中所述水浴的温度优选为90～100℃，进一步优选为100℃，所述水浴的时间优选为50～70min，进一步优选为60min。
33.在本发明中，步骤(3)中所述平衡的温度优选为23～27℃，进一步优选为25℃，所述离心的转速优选为2800～3200r/min，进一步优选为3000r/min，所述离心的时间优选为50～70s，进一步优选为60s。
34.在本发明中，步骤(4)中所述测定过程中gasbench ii样品盘的温度设定优选为23～27℃，进一步优选为25℃，色谱柱的温度设定优选为38～42℃，进一步优选为40℃，优选以流速为0.4～0.6ml/min的氦气作为载气，进一步优选为0.5ml/min的氦气，0.6ml/min的氦气采用双孔采样针采集顶空二氧化碳，0.6ml/min的氦气80～120μl定量环进样，进一步优选为100μl定量环进样，120μl定量环进样经过色谱柱和干燥器后引入irms，进行δ
13
c分析。
35.在本发明中，每个样品120μl定量环进样重复定量环进样8～12次，进一步优选为10次。
36.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.实施例1
38.本实施例一种微量线虫样品碳稳定同位素测试方法，其步骤如下：
39.一、反应试剂的配制：称取4g过硫酸钠和1g无水磷酸，统一溶于100ml煮沸去离子水中，充分混匀，冷却，密封保存。
40.二、湿氧化法：使用经过高温灭菌处理的12ml规格的样品瓶，装入50头线虫样品和1ml反应试剂，封盖。通入高纯氦气吹扫样品瓶顶空，赶走瓶内空气，流速设为100ml/min，吹扫330s。在100℃条件下水浴60min，将线虫体内的碳全部氧化成二氧化碳。在25℃条件下平衡12h，确保瓶内水汽充分冷凝，放至离心机3000r/min离心1min去除瓶盖及内壁附着的水珠，防止堵塞采样针。
41.三、测量
42.采用gasbench-irms测定由微量线虫样品转化的二氧化碳气体。gasbench ii样品盘温度设定25℃，色谱柱温度设定40℃；以流速0.5ml/min氦气作载气，双孔采样针采集顶空二氧化碳，100μl定量环进样，经过色谱柱和干燥器，引入irms，进行δ
13
c分析。每个样品重复定量环进样10次(10个样品峰)。本实验每个线虫样品后10个峰对应δ13c的测定内精度均好于0.05
‰
。
43.利用usgs40国际标准样品对本方法进行精密度和准确度验证，测定结果，见表1，测试结果表明本方法是准确可行的。
44.表1
45.样品名称测试方法标准值δ
13cvpdb
‰
平均值标准偏差
ꢀꢀꢀ‑
26.387
ꢀꢀ
usgs40标样ea-irms-26.39-26.374-26.3870.013
ꢀꢀꢀ‑
26.399
ꢀꢀꢀꢀꢀ‑
26.379
ꢀꢀ
usgs40标样gasbench-irms-26.39-26.364-26.3880.030
ꢀꢀꢀ‑
26.421
ꢀꢀ
46.实施例2
47.本实施例一种微量线虫样品碳稳定同位素测试方法，其步骤如下：
48.一、反应试剂的配制：称取4g过硫酸钠和1g无水磷酸，统一溶于100ml煮沸去离子水中，充分混匀，冷却，密封保存。
49.二、湿氧化法：使用经过高温灭菌处理的12ml规格的样品瓶，装入50头线虫样品和1ml反应试剂，封盖。通入高纯氦气吹扫样品瓶顶空，赶走瓶内空气，流速设为100ml/min，吹扫330s。在100℃条件下水浴60min，将线虫体内的碳全部氧化成二氧化碳。在25℃条件下平衡12h，确保瓶内水汽充分冷凝，放至离心机3000r/min离心1min去除瓶盖及内壁附着的水珠，防止堵塞采样针。
50.三、测量
51.采用gasbench-irms测定由微量线虫样品转化的二氧化碳气体。gasbench ii样品盘温度设定25℃，色谱柱温度设定40℃；以流速0.5ml/min氦气作载气，双孔采样针采集顶空二氧化碳，100μl定量环进样，经过色谱柱和干燥器，引入irms，进行δ
13
c分析。每个样品重复定量环进样10次(10个样品峰)。本实验每个线虫样品后10个峰对应δ13c的测定内精度均好于0.05
‰
。
52.利用usgs40国际标准样品对本方法进行精密度和准确度验证，测定结果，见表2，测试结果表明本方法是准确可行的。
53.表2
54.样品名称测试方法线虫数量δ13cvpdb
‰
平均值标准偏差
ꢀꢀꢀ‑
22.041
ꢀꢀ
实验室培养线虫ea-irms1000-22.018-22.0510.040
ꢀꢀꢀ‑
22.095
ꢀꢀꢀꢀꢀ‑
22.096
ꢀꢀ
实验室培养线虫gasbench-irms50-22.001-22.0410.049
ꢀꢀꢀ‑
22.027
ꢀꢀ
55.实施例3
56.本实施例一种微量线虫样品碳稳定同位素测试方法，其步骤如下：
57.一、反应试剂的配制：称取4g过硫酸钠和1g无水磷酸，统一溶于100ml煮沸去离子水中，充分混匀，冷却，密封保存。
58.二、湿氧化法：使用经过高温灭菌处理的12ml规格的样品瓶，装入50头线虫样品和1ml反应试剂，封盖。通入高纯氦气吹扫样品瓶顶空，赶走瓶内空气，流速设为100ml/min，吹扫330s。在100℃条件下水浴60min，将线虫体内的碳全部氧化成二氧化碳。在25℃条件下平衡12h，确保瓶内水汽充分冷凝，放至离心机3000r/min离心1min去除瓶盖及内壁附着的水珠，防止堵塞采样针。
59.三、测量
60.采用gasbench-irms测定由微量线虫样品转化的二氧化碳气体。gasbench ii样品盘温度设定25℃，色谱柱温度设定40℃；以流速0.5ml/min氦气作载气，双孔采样针采集顶空二氧化碳，100μl定量环进样，经过色谱柱和干燥器，引入irms，进行δ
13
c分析。每个样品重
复定量环进样10次(10个样品峰)。本实验每个线虫样品后10个峰对应δ13c的测定内精度均好于0.05
‰
。
61.利用usgs40国际标准样品对本方法进行精密度和准确度验证，测定结果，见表3，测试结果表明本方法是准确可行的。
62.表3
[0063][0064][0065]
由以上实施例可知，本发明提供了一种微量样品中碳稳定同位素的测定方法，包括如下步骤：(1)将过硫酸钠、无水磷酸和水按照3.8～4.2g：0.9～1.1g：100ml的用量比混合，得到反应试剂；(2)将样品和反应试剂在反应容器中混合，在反应容器中构建氦气环境，水浴后将样品中的碳元素氧化成二氧化碳；(3)将水浴后的反应容器平衡10～14h，离心；(4)采用gasbench-irms测定二氧化碳，进行δ
13
c分析。本发明通过湿氧化法将微量线虫样品体内的碳氧化生成二氧化碳，采用gasbench-irms测定由微量线虫样品转化的二氧化碳气体，在保证测试精度和准确度基础上减少了测试所需的样品量5～10倍，大大提高工作效率，节约人力物力。
[0066]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。