一种基于纳米平台和双信号放大的比率荧光生物传感器的构建及miRNA检测应用

一种基于纳米平台和双信号放大的比率荧光生物传感器的构建及mirna检测应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于纳米平台和双信号放大的比率荧光生物传感器的构建及mirna检测应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.microrna(mirna)是一类具有18～24个碱基的单链非编码rna，已被证实在发育、器官生成、代谢、病毒防御和肿瘤发展中起重要的调节作用。据报道，特定mirna的异常表达与包括癌症、糖尿病、心脑血管疾病、神经系统疾病和炎症在内的诸多疾病有关。因此，某些mirna被认为是某些疾病的预测生物标志物。外泌体是一类细胞分泌的囊泡，它们通过转移核酸、蛋白质、脂质和其它分子来介导细胞间通讯并调节受体细胞的组成和功能。外泌体被认为是血清中mirna的主要载体，疾病发展过程中的生理变化可以触发特定外泌体mirna的产生，外泌体mirna检测显示出用于疾病诊断的前景。癌症是世界范围内的主要公共卫生问题。为了推动癌症的有效防治、降低居民癌症的发病率和死亡率、减少社会经济成本，癌症的早期筛查显得尤为重要。
4.就发病率和死亡率而言，结直肠癌分别位列各种癌症的第三位和第二位。结直肠癌发作隐匿，通常很难在其早期阶段检测到，超过50％的结直肠癌患者在确诊时已经发生转移。因此，迫切需要开发灵敏的新型结直肠癌诊断技术。近年来，利用快速、准确、无创或微创的新型肿瘤标志物(如循环肿瘤细胞、mirna)液体活检进行癌症早筛成为研究热点。已经证实mir-92a-3p的过表达与结直肠癌细胞的增殖有关。与血清中的mir-92a-3p相比，健康个体和结直肠癌患者之间的外泌体mir-92a-3p水平差异更加显著。因此，对外泌体mir-92a-3p的灵敏液体活检在早期结直肠癌筛查中具有重要意义。常规的rna检测方法如实时定量聚合酶链式反应、微阵列分析和northern印迹已在临床应用。然而，这些常规方法的便携性差、程序复杂并且依赖昂贵的设备，因此需要开发便捷、快速、廉价的新型液体活检技术。
5.基于荧光原理的检测是一种很有前途的技术，以其高灵敏度、快速响应和操作简单等优点而受到认可。基于测量荧光强度绝对变化的检测容易受到核酸降解、激发光源稳定性和热力学波动等因素的影响。鉴于生物样品的复杂组成，应开发抗干扰荧光的mirna检测技术。由于具有自参考能力，比率荧光能够通过计算具有不同发射波长的两种不同荧光物质的荧光强度比值来抵消干扰因素的影响，使得检测结果更加可靠。据我们所知，目前关于mir-92a-3p比率荧光检测技术的开发尚未受到广泛关注。因此，构建比率荧光生物传感器以实现对包括结直肠癌特异性mir-92a-3p在内的各种癌症特异性mirna的灵敏检测具有新颖性和应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对当前采用比率荧光技术检测结直肠癌生物标志物mir-92a-3p研究的空白，提出了一种由dna(dna探针p1)为模板的ag-au纳米簇(ag-auncs/p1)和au纳米颗粒/g-c3n4纳米片(aunps/g-c3n4)组成的纳米平台与催化发夹组装和序列诱导荧光增强相结合的比率荧光生物传感器用于检测mir-92a-3p。
7.在氮气气氛下高温加热尿素制备g-c3n4。在添加有g-c3n4的水溶液中通过柠檬酸钠还原haucl4制备aunps/g-c3n4。在冰浴温度下，通过在含有dna探针p1的水溶液中用nabh4还原agno3和haucl4制备ag-auncs/p1。
8.将ag-auncs/p1、aunps/g-c3n4、dna探针p2、dna探针p3和待测mir-92a-3p加至含缓冲液(ph7.4)的超纯水中孵育一段时间，进行荧光测量。当不存在mir-92a-3p时，aunps/g-c3n4吸附ag-auncs/p1并通过光诱导电子转移和聚集猝灭ag-auncs/p1的荧光。当mir-92a-3p存在时，ag-auncs/p1、dna探针p2与dna探针p3经过催化发夹组装反应生成dna双链从而离开aunps/g-c3n4的表面并恢复荧光发射，催化发夹组装循环为第一级信号放大。此外，核酸序列设计使得dna双链中ag-auncs/p1的荧光显著增强，形成第二级信号放大。aunps/g-c3n4的稳定蓝色荧光做参照，ag-auncs/p1的红色荧光随mir-92a-3p浓度的增大而增强，依据mir-92a-3p浓度与ag-auncs/p1/aunps/g-c3n4荧光强度比值之间的标准曲线计算待测mir-92a-3p的浓度。
9.本发明灵敏度高、特异性好、便捷，是一种用于mirna检测的新颖方法。
10.本发明提供如下技术方案：
11.本发明的第一方面，提供一种基于纳米平台和双信号放大的比率荧光生物传感器，所述比率荧光生物传感器包括aunps/g-c3n4、ag-auncs/p1、dna探针p2、dna探针p3；其中，在含有g-c3n4的水溶液中通过柠檬酸钠还原haucl4制备得到aunps/g-c3n4；通过在含有dna探针p1的水溶液中用nabh4还原agno3和haucl4制备得到ag-auncs/p1；所述dna探针p1的序列为(5
’‑3’
)：ccccccccacaggccgggacaagtgcaatatcccggcct，如seq id no.1所示；所述dna探针p2的序列为(5
’‑3’
)：gggacaagtg caaaggccgggatattgcacttgtcccggccggaaggttggt，如seq id no.2所示；所述dna探针p3的序列为(5
’‑3’
)：gcacttgtccc，如seq id no.3所示。
12.本发明的第二方面，提供上述比率荧光生物传感器组分的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)在氮气气氛下高温加热尿素制备g-c3n4；通过超声破碎g-c3n4制得g-c3n4纳米片水溶液；
14.(2)将haucl4水溶液添加到g-c3n4纳米片水溶液中，在持续搅拌下添加柠檬酸钠水溶液，加热保温，冷却至室温后用超纯水透析，得到aunps/g-c3n4水溶液；
15.(3)将柠檬酸盐缓冲液在冰浴温度下搅拌，添加dna探针p1并搅拌，添加agno3水溶液和haucl4水溶液并在黑暗中搅拌，添加nabh4水溶液剧烈搅拌，将溶液在室温下于黑暗环境中静置，用超纯水透析获得纯化的ag-auncs/p1水溶液。
16.进一步的，步骤(1)中，所述尿素的加热温度为500～600℃，加热时间为1～4h。
17.进一步的，步骤(1)中，将g-c3n4分散在超纯水中，在200～500w的功率下破碎12～36h，得到g-c3n4纳米片水溶液。
18.进一步的，步骤(1)中，g-c3n4纳米片水溶液的浓度为2mg/ml。
19.进一步的，步骤(2)中，haucl4水溶液、g-c3n4纳米片水溶液、柠檬酸钠水溶液的体积比为：0.1：2：0.5；其中，haucl4水溶液的浓度为0.1m，柠檬酸钠水溶液的浓度为80mm。
20.进一步的，步骤(2)中，加热至80～90℃保温5～30min；降至室温后用超纯水透析12～48h。
21.进一步的，步骤(3)中，柠檬酸盐缓冲液浓度为50mm，ph 5；dna探针p1浓度为100μm；agno3水溶液浓度为1mm；haucl4水溶液浓度为1mm；nabh4水溶液浓度为1mm；柠檬酸盐缓冲液、dna探针p1、agno3水溶液、haucl4水溶液、nabh4水溶液的体积分别为0.66ml、50μl、95μl、95μl和95μl。
22.进一步的，步骤(3)中，在冰浴温度下，向柠檬酸盐缓冲液(ph5)中添加dna探针p1搅拌10～30min，添加agno3水溶液和haucl4水溶液并在黑暗中搅拌10～60min，添加nabh4水溶液剧烈搅拌2～5min，在室温下于黑暗环境中静置4～12h，用超纯水透析12～48h。
23.本发明的第三方面，提供上述比率荧光生物传感器在mirna检测中的应用，所述应用具体为：将ag-auncs/p1、aunps/g-c3n4、dna探针p2、dna探针p3和待测mir-92a-3p加至缓冲液(ph7.4)中，37℃孵育3h；
24.用荧光分光光度计检测荧光信号，计算mir-92a-3p的浓度。
25.进一步的，aunps/g-c3n4、ag-auncs/p1、dna探针p2、dna探针p3、mir-92a-3p的体积分别为50μl、4μl、2μl、2μl和2μl，其中，dna探针p2浓度为10μm，dna探针p3浓度为10μm，mir-92a-3p浓度为0.1-50pm。
26.进一步的，所述待测mirna(mir-92a-3p)的序列为(5
’‑3’
)：tattg cacttgtcccggcctgt，如seq id no.4所示。
27.进一步的，ph7.4的缓冲液可以是tris-hcl缓冲液、tris-edta缓冲液、mes缓冲液、磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
28.进一步的，荧光分光光度计的参数设置：激发波长为375nm，收集荧光发射光谱范围为405～710nm。
29.本发明的有益效果在于：
30.本发明通过构建由dna(dna探针p1)为模板的ag-au纳米簇(ag-auncs/p1)和au纳米颗粒/g-c3n4纳米片(aunps/g-c3n4)组成的纳米平台与催化发夹组装和序列诱导荧光增强相结合的比率荧光生物传感器实现了对外泌体中mir-92a-3p的灵敏检测。该比率荧光生物传感器能够检测的mir-92a-3p浓度范围为0.1-50pm，检测限低至0.047pm。该传感器不仅能够检测结直肠癌相关的mirna(mir-92a-3p)，也可以通过替换相应的复合探针体系检测其它疾病相关的mirna，在疾病检测领域具有广阔的应用前景。本发明可为mirna的灵敏、特异性检测提供新途径，推动生物检测技术领域的发展。
附图说明
31.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
32.图1为实施例1的g-c3n4的透射电镜图；
33.图2为实施例1的aunps/g-c3n4的透射电镜图；
34.图3为实施例1的ag-auncs/p1的透射电镜图；
35.图4为实施例1的ag-auncs/p1的紫外-可见吸收光谱；
36.图5为实施例1的梯度mir-92a-3p浓度与荧光检测信号之间的拟合直线。
具体实施方式
37.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
38.一种基于纳米平台和双信号放大的比率荧光生物传感器的构建及mirna检测应用，包括以下步骤：
39.(1)将10g尿素置于陶瓷坩埚中、加盖并转移至管式炉中，用氮气吹扫30min以排除管内空气，将管式炉以3℃/min的速率升温至550℃并保温2h，待管式炉自然冷却至环境温度制得g-c3n4，将0.1g的g-c3n4分散在50ml超纯水中，在360w的功率下破碎16h，得到浓度为2mg/ml的g-c3n4纳米片水溶液；
40.(2)将0.1ml的haucl4水溶液(0.1m)添加到2ml的g-c3n4纳米片水溶液(2mg/ml)中超声处理5min，在持续搅拌下添加0.5ml的柠檬酸钠水溶液(80mm)，将该混合溶液加热至85℃并保温5min，溶液降至室温后在24h内用超纯水透析4次，得到浓度为2.3mg/ml的aunps/g-c3n4水溶液；
41.(3)将0.66ml的柠檬酸盐缓冲液(ph 5，50mm)在冰浴温度下搅拌5min，添加50μl的dna探针p1(100μm)搅拌15min，添加95μl的agno3水溶液(1mm)和95μl的haucl4水溶液(1mm)并在黑暗中搅拌30min，添加95μl的nabh4水溶液(1mm)剧烈搅拌2min，将溶液在室温下于黑暗环境中静置6h，在24h内用超纯水透析4次获得纯化的ag-auncs/p1水溶液；
42.(4)将50μl的aunps/g-c3n4、4μl的ag-auncs/p1(dna探针p1的浓度为5μm)、2μl的dna探针p2(10μm)、2μl的dna探针p3(10μm)和2μl不同浓度(0.1-50pm)的mir-92a-3p添加到1ml含有缓冲液(ph7.4)的超纯水中，于37℃孵育3h，通过添加超纯水将溶液体积定为2ml用于荧光测量并依据测量结果绘制标准曲线，激发波长为375nm，收集405-710nm区间的荧光发射谱。
43.所述dna探针p1的序列为(5
’‑3’
)：ccccccccacaggccgggaca agtgcaatatcccggcct。
44.所述dna探针p2的序列为(5
’‑3’
)：gggacaagtgcaaaggccgg gatattgcacttgtcccggccggaaggttggt。
45.所述dna探针p3的序列为(5
’‑3’
)：gcacttgtccc。
46.所述待测mirna(mir-92a-3p)的序列为(5
’‑3’
)：tattgcacttgtc ccggcctgt。
47.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
48.实施例1：
49.制备g-c3n4纳米片水溶液：将10g尿素置于陶瓷坩埚中、加盖并转移至管式炉中，用氮气吹扫30min以排除管内空气，将管式炉以3℃/min的速率升温至550℃并保温2h，待管式炉自然冷却至环境温度制得g-c3n4。将0.1g的g-c3n4分散在50ml超纯水中，在360w的功率下
破碎16h，得到浓度为2mg/ml的g-c3n4纳米片水溶液，其透射电镜图如图1所示。
50.制备aunps/g-c3n4水溶液：将0.1ml的haucl4水溶液(0.1m)添加到2ml的g-c3n4纳米片水溶液(2mg/ml)中超声处理5min，在持续搅拌下添加0.5ml的柠檬酸钠水溶液(80mm)，将该混合溶液加热至85℃并保温5min，溶液降至室温后在24h内用超纯水透析4次得到浓度为2.3mg/ml的aunps/g-c3n4水溶液，其透射电镜图如图2所示。
51.制备ag-auncs/p1水溶液：将0.66ml浓度为50mm的柠檬酸盐缓冲液(ph 5)在冰浴温度下搅拌5min，添加50μl的dna探针p1(100μm)搅拌15min，添加95μl的agno3水溶液(1mm)和95μl的haucl4水溶液(1mm)并在黑暗中搅拌30min，添加95μl的nabh4水溶液(1mm)剧烈搅拌2min，将溶液在室温下于黑暗环境中静置6h，在24h内用超纯水透析4次获得纯化的ag-auncs/p1水溶液，其透射电镜图如图3所示。图4为ag-auncs/p1水溶液的紫外-可见吸收光谱，位于260nm和520nm附近的吸收峰分别归属于dna探针p1和ag-auncs。
52.荧光测试与标准曲线绘制：将50μl的aunps/g-c3n4、4μl的ag-auncs/p1(dna探针p1的浓度为5μm)、2μl的dna探针p2(10μm)、2μl的dna探针p3(10μm)和2μl不同浓度(0.1-50pm)的mir-92a-3p添加至1ml含有20μl tris-hcl缓冲液(ph7.4，0.5m)的超纯水中，于37℃孵育3h。通过添加超纯水将溶液体积定为2ml用于荧光测量，激发波长为375nm，收集405-710nm区间的荧光发射谱。以ag-auncs/p1/aunps/g-c3n4荧光强度比值为纵坐标，以mir-92a-3p浓度为横坐标，线性拟合各点得到如图5所示的标准曲线，线性浓度范围为0.1-50pm，依据3σ法计算得到检测限为0.047pm。
53.外泌体mir-92a-3p浓度检测：将50μl的aunps/g-c3n4、4μl的ag-auncs/p1(dna探针p1的浓度为5μm)、2μl的dna探针p2(10μm)、2μl的dna探针p3(10μm)和2μl提取自外泌体的mir-92a-3p水溶液添加至1ml含有20μl tris-hcl缓冲液(ph7.4，0.5m)的超纯水中，于37℃孵育3h。通过添加超纯水将溶液体积定为2ml用于荧光测量，激发波长为375nm，收集405-710nm区间的荧光发射谱。将得到的ag-auncs/p1/aunps/g-c3n4荧光强度比值代入图5中的拟合方程，计算出外泌体mir-92a-3p的浓度为1.31pm，接近用rt-qpcr测试的结果1.3pm，表明该检测方法具有良好的准确性。
54.所述dna探针p1的序列为(5
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)：ccccccccacaggccgggaca agtgcaatatcccggcct。
55.所述dna探针p2的序列为(5
’‑3’
)：gggacaagtgcaaaggccgg gatattgcacttgtcccggccggaaggttggt。
56.所述dna探针p3的序列为(5
’‑3’
)：gcacttgtccc。
57.所述待测mirna(mir-92a-3p)的序列为(5
’‑3’
)：tattgcacttgtc ccggcctgt。
58.实施例2：
59.将50μl的aunps/g-c3n4、4μl的ag-auncs/p1(dna探针p1的浓度为5μm)、2μl的dna探针p2(10μm)、2μl的dna探针p3(10μm)添加至1ml含有20μl tris-hcl缓冲液(ph7.4，0.5m)的超纯水中，以上溶液一式三份。向上述三份溶液中分别加入2μl浓度均为10pm的不同mir-92a-3p错配序列(单碱基错配(stm)、双碱基错配(tmt)和完全碱基错配(nct))，于37℃孵育3h。通过添加超纯水将溶液体积定为2ml用于荧光测量，激发波长为375nm，收集405-710nm区间的荧光发射谱。将得到的ag-auncs/p1/aunps/g-c3n4荧光强度比值代入图5中的拟合方程，计算出stm、tmt和nct的浓度分别为0.015pm、0.015pm和0.011pm，远低于其实际浓度，证
明错配序列不能引起荧光信号的显著变化，表明该检测方法具有良好的特异性。在本实施例中，smt的序列为(5
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)：tattccacttgtcccggcctgt(如seq id no.5所示)，tmt的序列为(5
’‑3’
)：ttttccacttgtcccggcctgt(如seq id no.6所示)，nct的序列为(5
’‑3’
)：ttttccacttgtcccggcctgt(如seq id no.7所示)。
60.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。