1.本发明涉及药物分析技术领域，具体而言，涉及一种拉洛他赛含量及其有关物质的检测方法和应用。
背景技术：2.众所周知，只有保证药物的纯度，才能保证药物的有效和安全，因此，药物纯度的检测方法就显得尤为重要，有关物质(telated substances)是指在原料药生产中带入的起始物料、试剂、中间体、副产物等物质，也可能是制剂在生产、储藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。有关物质的种类与药物的合成路线和生产工艺密切相关，不同的合成路线和生产工艺，药品的杂质谱也会发生变化，因此，需要根据不同的合成路线和生产工艺建立合适的分析方法，达到对药物有关物质准确、有效的检测和监控。
3.目前，对于药物纯度的检测方法有多种，其中，有关物质检测是控制药品质量的重要指标。
4.拉洛他赛是化学药品1.1类新药，为第一代紫杉烷类抗肿瘤药，与紫杉醇和多西他赛的作用机制相同，拉洛他赛通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络从而起到抗肿瘤作用。目前拉洛他赛及其相关制剂没有其含量和有关物质的相关检测方法。
5.鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：6.本发明的目的在于提供一种拉洛他赛含量及其有关物质的检测方法和应用，以改善上述技术问题。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供了一种拉洛他赛有关物质的检测方法，其包括：采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测。
9.其中，高效液相色谱的条件包括：
10.检测波长：228～232nm；
11.流动相a：0.04wt％～0.06wt％磷酸水；流动相b：乙腈；
12.采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，洗脱程序如下：0～5min内，流动相a和流动相b的体积比为59～61：41～39；5～20min内，流动相a和流动相b的体积比从59～61：41～39变至49：51；20～30min内，流动相a和流动相b的体积比为49:51；30～35min内，流动相a和流动相b的体积比从49：51变至45：55；35～55min内，流动相a和流动相b的体积比为45：55；55～56min内，流动相a和流动相b的体积比从45：55变至59～61：41～39；56min～65min内，流动相a和流动相b的体积比为59～61：41～39。
13.有关物质包括llts-i5、llts-i6、llts-i7和llts-i8，llts-i5、llts-i6、llts-i7
和llts-i8的化学结构式依次为：i8的化学结构式依次为：
14.第二方面，本发明还提供了一种拉洛他赛含量的检测方法，其包括：将同体积的供试品溶液、拉洛他赛对照品溶液分别在高效液相色谱仪上进行检测后，采用外标法对供试品溶液中的拉洛他赛进行计算。
15.高效液相色谱的检测条件包括：
16.色谱柱为c18色谱柱和c30色谱柱中的任一种，色谱柱的柱温为25～35℃；
17.检测波长：228～232nm；
18.流动相a：0.04wt％～0.06wt％％磷酸水；流动相b：乙腈；
19.采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，梯度洗脱的流速为1.4～1.6ml/min；洗脱程序为：0～5min内，流动相a和流动相b的体积比为60：40；5～20min内，流动相a和流动相b的体积比从60：40变至49：51；20～30min内，流动相a和流动相b的体积比为49:51；30～35min内，流动相a和流动相b的体积比从49：51变至45：55；35～55min内，流动相a和流动相b的体积比为45：55；55～56min内，流动相a和流动相b的体积比从45：55变至60：40；56min～65min内，流动相a和流动相b的体积比为60：40。
20.第三方面，本发明还提供了上述拉洛他赛有关物质的检测方法或上述拉洛他赛含量的检测方法在拉洛他赛的原料或制剂的质量控制中的应用。
21.本发明具有以下有益效果：通过选择特定的高效液相色谱条件，特别是特定的梯度洗脱程序，可以特异性地对拉洛他赛的有关物质llts-i5、llts-i6、llts-i7和llts-i8实现检测，能够保证在以上各有关物质与有效成分高效分离的基础上，使其具有良好的专属性、重复性与准确度，从而更好地实现对拉洛他赛及相关制剂的质量控制。此外，以上拉洛他赛含量的检测方法，能够实现对拉洛他赛的高效、准确的定量检测。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。
23.图1为本发明实施例1提供的混合对照品定位溶液的色谱图；图2为本发明实施例1提供的混合对照品溶液的色谱图；图3为本发明实施例1提供的空白辅料溶液的色谱图；图4为本发明实施例1提供的供试品溶液的色谱图；图5为本发明实施例2提供的混合对照品溶液的色谱图；图6为本发明实施例2提供的空白辅料溶液的色谱图；图7为本发明实施例2提供的供试品溶液的色谱图；图8为本发明实施例3提供的混合对照品溶液的色谱图；图9为本发明实施例3提供的空白辅料溶液的色谱图；图10为本发明实施例3提供的供试品溶液的色谱图；图11为本发明实施例4提供的混合对照品溶液的色谱图；图12为本发明实施例4提供的空白辅料溶液的色谱图；图13为本发明实施例4提供的供试品溶液的色谱图；图14为本发明实施例5提供的混合对照品溶液的色谱图；图15为本发明实施例5提供的空白辅料溶液的色谱图；图16为本发明实施例5提供的供试品溶液的色谱图；图17为本发明实施例6提供的混合对照品溶液的色谱图；图18为本发明实施例6提供的空白辅料溶液的色谱图；图19为本发明实施例6提供的供试品溶液的色谱图；图20为本发明实施例7提供的混合对照品溶液的色谱图；图21为本发明实施例7提供的空白辅料溶液的色谱图；图22为本发明实施例7提供的供试品溶液的色谱图；图23为对比例1中检测结果，从上至下分别为系统适用性溶液、空白辅料和空白溶剂；图24为对比例2中检测结果，从上至下分别为乙醇溶样品、异丙醇溶样品和甲醇溶样品。
具体实施方式
24.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
25.具体实施方式中的对专属性、耐用性、线性、准确度、溶液稳定性、重复性、中间精密度、定量限、检测限等项目的验证，按照《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》、《化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则》、《化学药物杂质研究技术指导原则》、《化学药物残留溶剂研究技术指导原则》以及现行版《中华人民共和国药典》附录中有关的指导原则进行方法学验证。
26.下面对本发明提供的一种拉洛他赛含量及其有关物质的检测方法和应用进行具体说明。
27.本发明的一些实施方式提供了一种拉洛他赛有关物质的检测方法，其包括：采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测。
28.其中，高效液相色谱的条件包括：检测波长：228～232nm；流动相a：0.04wt％～0.06wt％磷酸水，优选为0.05wt％磷酸水；流动相b：乙腈；采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，洗脱程序如下：0～5min内，流动相a和流动相b的体积比为59～61：41～39；5～20min内，流动相a和流动相b的体积比从59～61：41～39变至49：51；20～30min内，流动相a和流动相b的体积比为49:51；30～35min内，流动相a和流动相b的体积比从49：51变至45：55；35～55min内，流动相a和流动相b的体积比为45：55；55～56min内，流动相a和流动相b的体积比从45：55变至59～61：41～39；56min～65min内，流动相a和流动相b的体积比为59～61：41～
39。
29.具体地，有关物质包括llts-i5、llts-i6、llts-i7和llts-i8，llts-i5、llts-i6、llts-i7和llts-i8的化学结构式依次为：i8的化学结构式依次为：
30.需要说明的是，洗脱程序0～5min内流动相a和流动相b的体积比保持一定比值不变，例如保持为60：40。
31.一些实施方式中，对洗脱程序进行进一步优化，优化后的洗脱程序如下：0～5min内，流动相a和流动相b的体积比为60：40；5～20min内，流动相a和流动相b的体积比从60：40变至49：51；20～30min内，流动相a和流动相b的体积比为49:51；30～35min内，流动相a和流动相b的体积比从49：51变至45：55；35～55min内，流动相a和流动相b的体积比为45：55；55～56min内，流动相a和流动相b的体积比从45：55变至60：40；56min～65min内，流动相a和流动相b的体积比为60：40。
32.进一步地，有关物质还包括llts-i1、llts-i2、llts-i4、llts-i9和llts-i10，llts-i1、llts-i2、llts-i4、llts-i9和llts-i10的化学结构式依次为：
33.以上实施方式的检测方法在同一色谱条件下，可以同时检测出llts-i1、llts-i2、llts-i4、llts-i5、llts-i6、llts-i7、llts-i8、llts-i9和llts-i10这9种有关物质，这些杂质与主峰直接的分离度均符合要求，可用于拉洛他赛原料及制剂的有关物质检测。
34.需要说明的是，以上9种有关物质中，有关物质llts-i1、llts-i2、llts-i4、llts-i6、llts-i8、llts-i9和llts-i10均为工艺杂质，有关物质llts-i5和llts-i7均为降解杂质。本发明实施方式，对检测条件的调控，能够一次性高效的分离检测出上述9种拉洛他赛的有关物质。
35.具体地，一些实施方式中，色谱的检测波长示例性地选择228nm、229nm、230nm、231nm、232nm等，优选为230nm。
36.一些实施方式中，梯度洗脱的流速为1.4～1.6ml/min，例如可为1.4ml/min、1.45ml/min、1.5ml/min、1.55ml/min或1.6ml/min，优选为1.5ml/min。
37.一些实施方式中，高效液相色谱的色谱柱为c18色谱柱和c30色谱柱中的任一种，优选为c30色谱柱。例如，可以选择为c30色谱柱，型号规格为thermo aclaim
tm
c30(4.6mm
×
150mm，3μm)。
38.一些实施方式中，色谱柱的柱温为25～35℃，优选为30℃。如在不同实施方式中，色谱柱的柱温可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃等。
39.一些实施方式中，检测时，进样量可以为10～20μl，如可以为10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl等，优选为10μl。
40.进一步地，一些实施方式中，将同体积的供试品溶液和对照溶液分别采用高效液相色谱进行检测，根据高效液相色谱检测结果分析有关物质。
41.或，将同体积的供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，采用外标法对供试品溶液中的有关物质进行计算。
42.在本发明的一些实施方式中，对照品溶液中包括有关物质llts-i5、llts-i6、llts-i7和llts-i8以及拉洛他赛。采用乙醇溶解各有关物质对照品以及拉洛他赛对照品，作为混合对照品溶液。其中，对照品溶液中，有关物质llts-i5、llts-i6、llts-i7和llts-i8的浓度分别均为1μg/ml，拉洛他赛的浓度为0.5mg/ml。
43.在本发明一些实施方式中，供试品选自含拉洛他赛的原料或制剂。优选地，供试品为拉洛他赛脂质微球注射液。
44.在本发明一些实施方式中，供试品溶液的制备方法包括：采用乙醇溶解供试品，离心，取上清液作为供试品溶液。其中，供试品溶液中，拉洛他赛的浓度可以为0.5mg/ml。具体操作时，供试品溶液中主成分的浓度不局限于此，只要满足其浓度
×
进样体积＞各杂质的
定量限即可。
45.本发明的一些实施方式还提供了一种拉洛他赛含量的检测方法，其包括：将同体积的供试品溶液、拉洛他赛对照品溶液分别在高效液相色谱仪上进行检测后，采用外标法对供试品溶液中的拉洛他赛进行计算；
46.高效液相色谱的检测条件包括：
47.色谱柱为c18色谱柱和c30色谱柱中的任一种，色谱柱的柱温为25～35℃；
48.检测波长：228～232nm；
49.流动相a：0.04wt％～0.06wt％％磷酸水；流动相b：乙腈；
50.采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，梯度洗脱的流速为1.4～1.6ml/min；洗脱程序为：0～5min内，流动相a和流动相b的体积比为60：40；5～20min内，流动相a和流动相b的体积比从60：40变至49：51；20～30min内，流动相a和流动相b的体积比为49:51；30～35min内，流动相a和流动相b的体积比从49：51变至45：55；35～55min内，流动相a和流动相b的体积比为45：55；55～56min内，流动相a和流动相b的体积比从45：55变至60：40；56min～65min内，流动相a和流动相b的体积比为60：40。
51.需要说明的是，以上拉洛他赛含量的检测方法中的色谱条件更进一步地具体选择可以参见上述实施方式中拉洛他赛有关物质的检测方法。
52.以上实施方式的检测条件，能够将拉洛他赛的有关物质在同一色谱条件中进行有效的分离及检测，同时还可对拉洛他赛的含量进行检测。
53.因此，本发明的一些实施方式还提供了上述拉洛他赛有关物质的检测方法或上述拉洛他赛含量的检测方法在拉洛他赛的原料或制剂的质量控制中的应用。
54.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
55.各实施例和比较例采用的为拉洛他赛脂质微球注射液，210801s批样品，厂家：山西振东制药股份有限公司。该制剂含拉洛他赛50mg，辅料+主药理论装量为50ml，其余均为辅料，主辅料种类如下。
56.拉洛他赛，主药，山西振东制药股份有限公司；
57.中链脂肪酸甘油酯，基质(油相)，辽宁新兴药业股份有限公司；
58.大豆油，基质(油相)润湿剂，辽宁新兴药业股份有限公司；
59.精制蛋黄卵磷脂，乳化剂，lipoid gmbh；
60.蛋黄磷脂酰甘油，辅助乳化剂，日本精化株式会社；
61.泊洛沙姆188，辅助乳化剂，巴斯夫(中国)有限公司；
62.甘油，渗透压调节剂，浙江遂昌惠康药业有限公司。
63.实施例1
64.本实施例提供了拉洛他赛有关物质的检测方法，包括如下步骤：
65.(1)混合对照品溶液和供试品溶液
66.混合对照品定位溶液的制备：取有关物质llts-i1、llts-i2、llts-i4、llts-i5、llts-i6、llts-i7、llts-i8、llts-i9和llts-i10，以及拉洛他赛对照品各适量，加乙醇溶解并稀释制成每lml中约含有关物质llts-i1、llts-i2、llts-i4、llts-i5、llts-i6、llts-i7、llts-i8、llts-i9和llts-i10各1μg，拉洛他赛1μg的溶液，作为混合对照品定位溶液；
67.混合对照品溶液的制备：取有关物质llts-i5、llts-i6、llts-i7和llts-i8、拉洛
他赛对照品各适量，加乙醇溶解并稀释制成每lml中约含有关物质llts-i5、llts-i6、llts-i7和llts-i8各1μg，拉洛他赛0.5mg的溶液，作为混合对照品溶液；
68.供试品溶液的制备：精密称取本品(210801s批样品)5ml(约相当于拉洛他赛5mg)，置10ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，离心(13000转/分钟，20分钟)，取上清液作为供试品溶液。
69.(2)高效液相色谱检测条件
70.仪器：agilent 1260高效液相色谱仪，dad检测器，检测波长：230nm；
71.色谱柱：thermo aclaim
tm c30(4.6mm
×
150mm，3μm)色谱柱；
72.流动相：流动相a和流动相b；
73.其中，流动相a的配制包括：取水1000ml与0.5ml磷酸混匀；流动相b为乙腈；
74.流速：1.5ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；按梯度表1进行线性梯度洗脱。
75.表1梯度洗脱程序表(体积比)
76.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0604056040204951304951354555554555566040656040
77.(3)检测步骤
78.分别精密量取混合对照品定位溶液(原料工艺中可能存在的杂质)、混合对照品溶液(制剂中可能存在的杂质)、空白辅料溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照步骤(2)中的条件分别进行检测，记录色谱图，见图1、图2、图3和图4。在图1中，9个杂质及拉洛他赛出峰顺序依次为有关物质llts-i5(6.068min)、有关物质llts-i10(11.084min)、有关物质llts-i4(16.695min)、有关物质llts-i7(17.430min)、拉洛他赛(22.543min)、有关物质llts-i8(24.333min)、有关物质llts-i2(26.160min)、有关物质llts-i1(28.596min)、有关物质llts-i9(41.497min)和有关物质llts-i6(48.524min)，各杂质之间、杂质与主成分之间分离度良好，具体见表2。在图2中，4个杂质及拉洛他赛出峰顺序依次为有关物质llts-i5(6.183min)、有关物质llts-i7(17.645min)、拉洛他赛(22.863min)、有关物质llts-i8(24.735min)、有关物质llts-i6(49.579min)，各杂质之间、杂质与主成分之间分离度良好，具体见表3。
79.表2各成分之间的分离数据
[0080][0081][0082]
表3各成分之间的分离数据
[0083]
化合物保留时间(min)分离度理论板数拖尾因子有关物质llts-i56.183/44360.81有关物质llts-i717.64531.09371570.99拉洛他赛22.86313.56514910.98有关物质llts-i824.7354.41491200.89有关物质llts-i649.57932.21438140.90
[0084]
下述实施例2-7为通过改变流速(
±
0.1ml/min)、柱温(
±
5℃)、不同检测波长(
±
2nm)等条件，考察测定结果不受影响的承受程度。通过各杂质之间的分离度来衡量。分别精密量取混合对照品溶液(制剂中可能存在的杂质)、空白辅料溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。
[0085]
实施例2
[0086]
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，流速为1.4ml/min。各杂质之间、杂质与主成分之间分离度见表4。记录色谱图，见图5、图6、图7。
[0087]
表4各成分之间的分离数据
[0088]
化合物保留时间(min)分离度理论板数拖尾因子有关物质llts-i56.615/47270.81有关物质llts-i718.34131.27403500.96拉洛他赛23.68013.55502030.97有关物质llts-i825.6664.44476150.93有关物质llts-i651.54231.21421220.86
[0089]
实施例3
[0090]
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，流速为1.6ml/min。各杂质之间、杂质与主成分之间分离度见表5。记录色谱图，见图8、图9、图10。
[0091]
表5各成分之间的分离数据
[0092]
化合物保留时间(min)分离度理论板数拖尾因子有关物质llts-i55.838/42370.80有关物质llts-i717.10531.10349880.97拉洛他赛22.25113.66526740.97有关物质llts-i824.0374.32477110.87有关物质llts-i648.17631.67433520.85
[0093]
实施例4
[0094]
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，柱温为25℃。各杂质之间、杂质与主成分之间分离度见表6。记录色谱图，见图11、图12、图13。
[0095]
表6各成分之间的分离数据
[0096]
化合物保留时间(min)分离度理论板数拖尾因子有关物质llts-i56.396/45980.81有关物质llts-i717.88430.85379151.00拉洛他赛23.30213.74489920.98有关物质llts-i825.3454.58462950.91有关物质llts-i650.57231.74412590.84
[0097]
实施例5
[0098]
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，柱温为35℃。各杂质之间、杂质与主成分之间分离度见表7。记录色谱图，见图14、图15、图16。
[0099]
表7各成分之间的分离数据
[0100]
化合物保留时间(min)分离度理论板数拖尾因子有关物质llts-i55.989/42640.79有关物质llts-i717.43831.14358800.98拉洛他赛22.49513.33531610.97有关物质llts-i824.2274.20497680.93有关物质llts-i648.69637.01481450.87
[0101]
实施例6
[0102]
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，检测波长为228nm。各杂质之间、杂质与主成分之间分离度见表8。记录色谱图，见图17、图18、图19。
[0103]
表8各成分之间的分离数据
[0104]
化合物保留时间(min)分离度理论板数拖尾因子有关物质llts-i56.205/40880.83有关物质llts-i717.68829.93348670.97拉洛他赛22.91213.18489330.97有关物质llts-i824.7914.27453440.93
有关物质llts-i649.67731.28443660.85
[0105]
实施例7
[0106]
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，检测波长为232nm。各杂质之间、杂质与主成分之间分离度见表9。记录色谱图，见图20、图21、图22。
[0107]
表9各成分之间的分离数据
[0108]
化合物保留时间(min)分离度理论板数拖尾因子有关物质llts-i56.205/41110.84有关物质llts-i717.68830.00348980.95拉洛他赛22.91213.16488780.98有关物质llts-i824.7904.28455520.91有关物质llts-i649.68430.84418520.83
[0109]
实施例8
[0110]
本实施例提供了拉洛他赛的含量的检测方法，包括如下步骤：
[0111]
(1)称取10.35mg拉洛他赛，溶解于100ml甲醇中，得到储备液；
[0112]
将储备液采用乙醇稀释，分别得到浓度为0.2569μg/ml、0.5139μg/ml、1.0278μg/ml、1.5416μg/ml、2.0555μg/ml、3.0833μg/ml、4.1110μg/ml(定量限浓度～0.8％浓度)的拉洛他赛的系列浓度溶液；
[0113]
(2)分别精密量取上述系列浓度溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照实施例1中步骤(2)中的条件进行检测，记录色谱图；测试结果见表10，以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，得到线性回归方程。
[0114]
表10拉洛他赛的线性测试结果
[0115][0116]
对比例1
[0117]
采用c18色谱柱对本品进行有关物质研究：
[0118]
色谱柱：agilent 5tc-c18(2)，5μm,250
×
4.6mm；检测波长：230nm；流速：1.0ml/min；流动相a：0.05％磷酸水，流动相b：乙腈；进样量：20μl。分别取空白溶剂(甲醇)，空白辅料、各杂质浓度均约为1μg/ml和拉洛他赛0.5mg/ml的系统适用性溶液进样，如图23所示，有关物质llts-i1、llts-i5和llts-i10与辅料峰重叠，该条件不利于杂质分离，检测。图23中，
图谱从上至下分别为系统适用性溶液、空白辅料和空白溶剂。
[0119]
表11对比例1的梯度洗脱程序(体积比)
[0120]
时间(min)流动相a(％)乙腈(％)04852204852304555503664753664804852854852
[0121]
对比例2
[0122]
取拉洛他赛脂质微球注射液适量，分别加甲醇、异丙醇和乙醇稀释1倍，甲醇和异丙醇溶解的样品经过滤过、取续滤液，乙醇溶解的样品放置后出现分层、经过离心、取上清液，进样检测，检测条件参考实施例1步骤(2)中的检测条件，区别在于，梯度洗脱程序如表12。测试结果见图24，图24中从上至下分别为乙醇溶样品、异丙醇溶样品和甲醇溶样品。从图24中可知，乙醇溶解的样品主峰后辅料峰减少，辅料对杂质检测干扰小。并且试验过程中可知，乙醇溶解的样品出现明显分层，有水相和油相层，可以离心取样，并且离心后注入色谱柱检测，对色谱柱污染小，减少色谱柱损耗。
[0123]
表12对比例2的梯度洗脱程序(体积比)
[0124]
时间(min)流动相a(％)乙腈(％)0604010604020514935514940455570455570.16040906040
[0125]
试验例1
[0126]
定量限与检测限
[0127]
分别取拉洛他赛及各杂质对照品储备液逐步稀释，制备定量限和检测限溶液，当信噪比s/n约为10时，作为定量限溶液；当信噪比s/n约为3时，作为检测限溶液；具体检测限溶液稀释过程及检测结果、定量限溶液稀释过程及检测结果分别见表13和14。
[0128]
表13检测限溶液稀释过程及检测结果
[0129]
[0130][0131]
其中，以拉洛他赛为例对其稀释方法进行说明：0.4ml
→
20ml，0.25ml
→
20ml，4ml
→
10ml是指，取0.4ml起始浓度为522.8145μg/ml的拉洛他赛储备液，稀释至20ml；再取稀释后的溶液0.25ml，稀释至20ml；再取稀释后的溶液4ml，稀释至10ml，得到检测限溶液。下表14中的定量限溶液稀释过程同理。其中，溶解采用甲醇，稀释采用的溶剂均为乙醇。
[0132]
表14定量限溶液稀释过程及检测结果
[0133][0134]
分别取上述有关物质llts-i5、有关物质llts-i7、拉洛他赛、有关物质llts-i6的定量限溶液，采用实施例1的色谱条件连续进样6次，测试结果见表15-18。从表中可知，各个杂质及拉洛他赛的定量限溶液连续进样6次，峰面积rsd均小于10.0％，保留时间rsd均小于1.0％，相对供试品百分浓度均远远小于0.1％，灵敏度符合要求。
[0135]
表15拉洛他赛定量限溶液6针进样结果
[0136][0137]
表16有关物质llts-i5定量限溶液6针进样结果
[0138][0139]
表17有关物质llts-i7定量限溶液6针进样结果
[0140][0141]
表18有关物质llts-i6定量限溶液6针进样结果
[0142][0143]
实验例2
[0144]
专属性实验数据及图谱
[0145]
以dad为检测器，考察210801s批样品(拉洛他赛脂质微球注射液，厂家：山西振东制药股份有限公司)，原料(批号：200701s，厂家：山西振东制药股份有限公司)，辅料(批号：20210802，厂家：山西振东制药股份有限公司)在强制降解条件下杂质降解情况，验证主峰纯度以及主峰与相邻杂质之间的分离度是否符合要求。测试结果分别见表19-20。其中表19为拉洛他赛原料破坏结果，表20为拉洛他赛脂质微球注射液破坏结果。
[0146]
表19原料专属性试验结果
[0147][0148]
表20制剂专属性试验结果
[0149][0150]
根据上述结果可知：各条件下，空白溶剂和空白辅料均不干扰杂质测定；主峰与相邻杂质及各杂质之间分离度均大于1.5；主峰纯度角均符合要求；样品在酸、碱、高温、光照和氧化条件下的降解杂质大部分都来源于原料；原料在高温、光照条件下，各成分均较为稳定，在酸、碱、氧化条件下，稳定性较差，能导致有关物质llts-i5和llts-i7降解增大；相对原料，制剂在各条件下稳定性相对较好，在酸、碱、氧化条件下有关物质llts-i5和llts-i7
稍有增长；以上各条件物料基本守恒。
[0151]
重复性
[0152]
平行配制6份供试品溶液，所有杂质按照自身对照法进行计算：6份样品的总杂为2.11％，rsd为2.24％；有关物质llts-i5为0.29％，rsd为9.91％；有关物质llts-i7为0.03％；单个最大单杂为0.14％，rsd为4.52％；杂质检出基本一致。
[0153]
中间精密度
[0154]
分别于不同日期、不同分析人员、采用不同仪器检测的12份样品，按照自身对照法计算，6份样品的总杂为2.00％，rsd为1.86％；有关物质llts-i5为0.23％，rsd为6.97％；有关物质llts-i7为0.04％；单个最大单杂为0.16％，rsd为3.95％；12份样品中杂质检出个数和大小基本一致，说明本法中间精密度良好。
[0155]
准确度
[0156]
有关物质llts-i5、有关物质llts-i6和有关物质llts-i7的9份样品的回收率均在80.0％～120.0％之间，平均回收率分别为99.42％、99.67％和101.41％，rsd分别为3.57％、7.47％和2.89％。
[0157]
具体的，分别配制有关物质llts-i5、有关物质llts-i6和有关物质llts-i7限度浓度(0.001mg/ml)的50％、100％、150％共3个浓度共9份回收率样品溶液，测定有关物质llts-i5、有关物质llts-i6和有关物质llts-i7的回收率。
[0158]
(1)杂质对照品贮备液：取有关物质llts-i5、有关物质llts-i6和有关物质llts-i7对照品各2mg，分别置不同20ml量瓶中，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别平行配制2份，作为高浓度杂质贮备液1和2。(均100μg/ml)
[0159]
(2)杂质对照品溶液：精密量取有关物质llts-i5、有关物质llts-i6和有关物质llts-i7对照品贮备液1、2各1ml，分别置不同10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液。(均1μg/ml)
[0160]
(3)杂质回收率贮备液：精密量取有关物质llts-i5、有关物质llts-i6和有关物质llts-i7贮备液1各2ml，置同一20ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为回收率贮备液。(均10μg/ml)
[0161]
(4)未加标供试品溶液：精密量取本品5ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，离心(13000转/分钟，20分钟)，取上层液；平行配制2份。
[0162]
(5)50％回收率溶液：精密量取本品5ml，置10ml量瓶中，精密加入0.5ml回收率贮备液，加乙醇稀释至刻度，摇匀，离心(13000转/分钟，20分钟)，取上层液；平行配制3份。
[0163]
(6)100％回收率溶液：精密量取本品5ml，置10ml量瓶中，精密加入1ml回收率贮备液，加乙醇稀释至刻度，摇匀，离心(13000转/分钟，20分钟)，取上层液；平行配制3份。
[0164]
(7)150％回收率溶液：精密量取本品5ml，置10ml量瓶中，精密加入1.5ml回收率贮备液，加乙醇稀释至刻度，摇匀，离心(13000转/分钟，20分钟)，取上层液；平行配制3份。
[0165]
分别杂质对照品溶液、未加标供试品溶液及不同浓度的加样回收率样品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质的含量及回收率，结果见表21-23。
[0166]
表21有关物质llts-i5回收率试验结果
[0167][0168]
表22有关物质llts-i6回收率试验结果
[0169][0170]
表23有关物质llts-i7回收率试验结果
[0171][0172]
溶液稳定性
[0173]
供试品溶液室温放置30h，有关物质llts-i5含量均值为0.24％，rsd值为9.65％，小于10％；有关物质llts-i7含量均值为0.04％；单个最大单杂均值为0.14％，rsd值为8.35％，小于15％；所以本品溶液在室温条件下放置30h稳定性良好。
[0174]
杂质校正因子
[0175]
有关物质llts-i5校正因子为0.8，有关物质llts-i6校正因子为1.9，有关物质
llts-i7校正因子为1.1。
[0176]
综上所述，与现有技术相比，本发明实施方式具有以下优势：
[0177]
(1)建立一类新药的有关物质和含量检测方法；
[0178]
(2)本发明的检测方法，在保证各有关物质与有效成分高效分离的基础上，使其具有良好的专属性、耐用性、重复性与准确度，从而更好地实现对拉洛他赛的原料或制剂的质量控制；
[0179]
(3)本发明通过调控色谱条件等，可实现一次性高效的分离出9种拉洛他赛的有关物质，建立了含拉洛他赛的原料或制剂，尤其是拉洛他赛脂质微球注射液中有关物质的研究方法，可以满足创新药的对于有关物质的控制要求。
[0180]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。