一种液质联用检测牧草中磺胺类药物残留的方法

本发明涉及药物残留检测，具体涉及一种液质联用检测牧草中磺胺类药物残留的方法。

背景技术：

1、磺胺类药物是一类人工合成的、具有对氨基苯磺酰胺结构的抗菌类药物，主要通过抑制敏感菌的叶酸代谢来实现抑菌、杀菌作用。目前已经有超过150种磺胺衍生物作为抗菌药用于人类和动物疾病的预防和治疗，也有一些磺胺类药物被用作抗原虫药物、抗真菌药物和除草剂(xie等，2020)。在畜禽养殖业中，磺胺类抗生素被广泛用于治疗和预防感染性疾病，促进动物生长以及提高饲料利用率。动物肠胃对抗生素的生物利用率有限，约60％～90％的抗生素会以药物原形或代谢物的形态通过排泄物排入环境中(bu等，2013；christou等，2018)，造成环境风险。由于抗生素大多较为稳定，部分抗生素固定相稳定存在150天以上，部分抗生素随着畜禽粪便进入土壤，在土壤中可持续5～9个月(kuppusamy等，2018；song等，2017)。在农业生态系统的各种介质(包括土壤、水、作物等)中都已检测到高浓度的磺胺类抗生素残留(yang等，2017)。当畜禽粪便直接用于农业施肥时，抗生素有可能在土壤中积累，并被作物吸收。有研究表明，抗生素有可能在不同的植物中积累，并通过食物链转移给人类，对公共健康构成潜在风险(倪治华等，2020)。因此，牧草中药物的残留量也是评判牧草品质优劣和进出口贸易的一个关键指标。

2、目前，磺胺类药物残留的检测方法主要有免疫法，例如胶体金免疫层析法(杜连启等，2014)、酶联免疫吸附法(杨华生等，2019)、放射性免疫法(苏明明等，2016)等。理化法，例如毛细管电泳法(贺晓丽等，2009)、气相-色谱质谱法(cannavan等，1996)、高效液相色谱法(蒋翠红等，2016)等。检测基质主要是畜禽肌肉组织、鸡蛋、血浆、蔬菜等(yu等，2018；穆小婷等，2021)。而针对牧草中磺胺类药物残留的检测方法还未见公开报道，因此，有必要对牧草中磺胺类药物残留的检测方法进行精准分析，而且研究牧草中磺胺类药物残留检测方法对于磺胺类药物残留风险评估、质量安全监管、牧草品质评价以及进出口检测等具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中没有适用于准确检测牧草中多种磺胺类药物残留的方法的缺陷，从而提供简便、快速、灵敏、准确且经济的一种液质联用检测牧草中磺胺类药物残留的方法。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方法：

3、一种牧草中磺胺类药物残留检测用供试品溶液的制备方法，包括：对牧草进行预处理，加入内标工作液和na2edta-mcllvaine缓冲液，再加入乙腈超声提取，然后加入无水硫酸钠和氯化钠离心获取提取液，经anavo que超滤净化柱分散净化，吹干，用甲酸水溶液-乙腈混合液溶解，经滤膜过滤，获得供试品溶液。

4、优选的，所述内标工作液为氘代磺胺邻二甲氧嘧啶、氘代磺胺间二甲苯嘧啶的混合内标工作液；所述内标工作液的溶剂为甲醇；以所述牧草质量为基准，所述内标工作液中氘代磺胺邻二甲氧嘧啶、氘代磺胺间二甲苯嘧啶的用量均为400～1000μl/g，质量浓度均为0.6～1.5mg/l。

5、优选的，所述na2edta-mcllvaine缓冲液的物质的量浓度为0.05-0.1mol/l；以所述牧草质量为基准，所述na2edta-mcllvaine缓冲液用量为10-20ml/g。

6、优选的，以所述牧草质量为基准，所述乙腈的用量为20-40ml/g。

7、优选的，以所述牧草质量为0.5g计，所述无水硫酸钠的用量为3-5g；所述氯化钠的用量为1-2g。

8、优选的，所述甲酸水溶液-乙腈混合液中，甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.05-0.1％，甲酸水溶液与乙腈的体积比为9:1。

9、优选的，所述预处理为剪碎、冷冻干燥、研磨成粉；

10、和/或，所述超声的频率为50～100hz，超声的时长为15-30min；

11、和/或，所述离心的转速为5000-10000r/min，离心的时长为5-10min；

12、和/或，所述吹干为在30-40℃下氮气吹干；

13、和/或，所述配制内标工作液的同时，还需配制混合标准溶液，所述混合标准溶液的溶剂为甲醇，混合标准工作液中磺胺类药物的质量浓度均为0.5～1.5mg/l。

14、优选的，所述磺胺类兽药为磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺对甲氧嘧啶中的至少一种。

15、本发明还提供一种液质联用检测牧草中磺胺类药物残留的方法，包括：获取上述的一种牧草中磺胺类药物残留检测用供试品溶液的制备方法获得的供试品溶液，采用超高效液相色谱-质谱联用的方法对供试品溶液进行检测。

16、优选的，所述超高效液相色谱的检测条件为：色谱柱为zorbax eclipse plusc18，2.1mm×100mm，1.8μm；流动相a为含有5mmol/l乙酸铵的甲酸水溶液；流动相b为甲醇；流速为0.3ml/min；进样量为5μl；柱温为35℃；梯度洗脱程序为：0-4min，5％b线性变化至20％b；4-6min，20％b线性变化至40％b；6-7min，40％b线性变化至100％b；7-8min，100％b线性变化至98％b；8-9min，98％b线性变化至5％b；9-10min，保持5％b；

17、和/或，所述质谱的检测条件为：电喷雾离子源，正离子扫描模式；多反应检测：毛细管电压为3000v；离子源温度为150℃；干燥气温度为150℃；干燥气流量为15l/min；鞘气温度为30psi；鞘气温度为300℃；鞘气流量为11l/min。

18、本发明技术方案，具有如下优点：

19、1.本发明提供的一种牧草中磺胺类药物残留检测用供试品溶液的制备方法，包括：对牧草进行预处理，加入内标工作液和na2edta-mcllvaine缓冲液，再加入乙腈超声提取，然后加入无水硫酸钠和氯化钠离心获取提取液，经anavo que超滤净化柱分散净化，吹干，用甲酸水溶液-乙腈混合液溶解，经滤膜过滤，获得供试品溶液。本发明中供试品的上述制备方法可以有效排除牧草中叶绿素等其他基质对磺胺类药物的提取干扰，获得更加准确的磺胺类药物的检测结果，进而可以达到以牧草为检测对象从源头降低磺胺类药物对畜产品的质量安全隐患的效果；本发明结合超高效液相色谱和质谱联用的方法对牧草样品中磺胺类药物残留进行检测，可以实现检测磺胺类药物在0.5～50μg/l范围内线性关系良好(r2>0.9960)的目的，且方法检出限为0.05～0.3μg/kg，定量限达到0.05～0.5μg/kg，在1、2、10μg/kg三个不同浓度水平下，磺胺类药物检测得到的回收率在70.1％～116.9％范围内，相对标准偏差为1.3％～10.3％，满足磺胺类药物残留分析检测要求的回收率在60％-120％范围内。

20、2.本发明提供的一种牧草中磺胺类药物残留检测用供试品溶液的制备方法，分散净化步骤中采用anavo que超滤净化柱对富含色素、纤维素和有机酸等复杂基质的牧草进行处理，相比于n-丙基乙二胺(psa)、十八烷基硅烷(c18)、石墨化碳黑(gcb)，anavo que超滤净化柱的净化效果更佳，进一步降低了对分析仪器的污染和损害，并且对目标物回收率基本无影响，除此之外，无需再进行后续涡旋、离心和洗脱处理，从而使得净化流程得到极大的简化，大幅降低了前处理时间和检测成本，同时对于耗材的消耗量更少。

21、3.本发明提供的一种液质联用检测牧草中磺胺类药物残留的方法，本方法操作简单、选择性好、灵敏度高，能够满足磺胺类药物残留检测的需要，可以为牧草中磺胺类药物残留风险评估、质量安全监管、牧草品质评价以及进出口检测等提供技术支持。