一种检测拉考沙胺对映异构体的反相液相色谱方法与流程

一种检测拉考沙胺对映异构体的反相液相色谱方法
1、技术领域
1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种反相液相色谱法分析测定拉考沙胺对映异构体的方法。
2、

背景技术：

2.拉考沙胺(lacosamide)是一种新型n-甲基-d-天门冬氨酸(nmda)受体甘氨酸位点结合拮抗剂，属于新一类功能性氨基酸，是具有全新作用机制的抗癫痫药物，具有广谱、高效、耐受性好和药代动力学理想的特点。由比利时ucb公司开发研制，已在美国、日本、欧洲、中国等多个国家和地区上市，用于治疗癫痫部分性发作。上市的剂型有片剂、注射液和口服溶液。
3.拉考沙胺的化学名为(r)-2-乙酰基氨基-n-苯甲基-3-甲氧基丙酰胺，结构式如下：
[0004][0005]
拉考沙胺存在一个手性中心，其对映异构体为s构型，化学名为(s)-2-乙酰胺基-n-苄基-3-甲氧基丙酰胺，其结构式如下：
[0006][0007]
拉考沙胺上市产品为r构型，其s构型是无活性的，所以在拉考沙胺及其制剂生产过程中的对映异构体检查对其用药安全性及有效性有着非常重要的意义。
[0008]
通过查阅中外文献及专利发现，已有相关文献报道采用高效液相色谱法测定拉考沙胺制备过程中的中间体光学异构体，基本均采用正相色谱系统，未见有反相高效液相色谱方法检测上述拉考沙胺对映异构体的报道，对于拉考沙胺注射液等溶液制剂，使用反相体系可直接稀释后进样检测，更有利于质量控制，避免了使用正相溶剂导致的不能互溶的情况，简化了处理步骤。因此建立一种灵敏度高、简便易行、普适性高的反相高效液相色谱方法用于测定拉考沙胺对映异构体是具必要性的。
3、

技术实现要素：

[0009]
为了解决目前技术问题，本发明通过大量实验探索后提供了一种采用反相色谱系统分离分析拉考沙胺对映异构体的方法，采用普通紫外检测器，操作简便易行，普遍适用性较高，并能达到较高灵敏度，能更好地控制拉考沙胺的产品质量。
[0010]
本发明提供了一种检测拉考沙胺对映异构体的反相液相色谱方法，包括以下步
骤：
[0011]
(1)系统适用性溶液的配制：取拉考沙胺及其对映异构体各适量，加流动相溶解并稀释制成系统适用性溶液；
[0012]
(2)供试品溶液的配制：取拉考沙胺供试品适量，用流动相溶解并稀释制成供试品溶液；
[0013]
(3)色谱实验：取系统适用性溶液和供试品溶液各适量，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0014]
步骤(3)中的具体色谱条件为：
[0015]
检测器：紫外检测器；
[0016]
色谱柱：硅胶表面涂覆纤维素-三-(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填料的多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，daicel chiralcel oz-rh 150mm
×
4.6mm，5μm；
[0017]
流动相：流动相a：醋酸铵溶液，其浓度为0.005～0.1mol/l，优选0.01mol/l，用冰醋酸调节ph值至3.5～6.5，优选5.8；流动相b：有机相，优选乙腈；流动相a：b＝85～65：15～35，优选比例为75∶25；
[0018]
流速：0.5～1.0ml/min，优选0.5ml/min；
[0019]
柱温：25～35℃，优选30℃；
[0020]
检测波长：200～225nm，优选210nm；
[0021]
进样体积：10μl；
[0022]
本发明进一步提供了一种检测拉考沙胺对映异构体的反相液相色谱方法，包括以下步骤：
[0023]
(1)系统适用性溶液的配制：取拉考沙胺及其对映异构体各适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含0.01mg的溶液。
[0024]
(2)供试品溶液的配制：取本品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含拉考沙胺0.1mg的溶液，作为供试品溶液。
[0025]
(3)色谱实验：取系统适用性溶液和供试品溶液各适量，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0026]
步骤(3)中的具体色谱条件为：
[0027]
检测器：紫外检测器；
[0028]
色谱柱：硅胶表面涂覆纤维素-三-(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填料的多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，daicel chiralcel oz-rh 150mm
×
4.6mm，5μm；
[0029]
流动相：流动相a：0.01mol/l醋酸铵溶液，用冰醋酸调节ph值至5.8；流动相b：乙腈；流动相a：b＝75∶25；
[0030]
流速：0.5ml/min；
[0031]
柱温：30℃；
[0032]
检测波长：210nm；
[0033]
进样体积：10μl；
[0034]
本发明与现有技术相比具有以下技术效果：
[0035]
1.本发明实现了对拉考沙胺及其对映异构体的有效分离和检测，所使用的反相色谱系统具有色谱溶剂性能稳定，分离能力强，操作过程简单，更易平衡等优点，普适性更强，
可直接用于拉考沙胺注射液等溶液制剂检测，操作更方便，能够更方便地实现对产品生产过程环节的质量控制，提高最终产品品质，保证临床用药的安全有效。
[0036]
2.本发明的定量限0.045μg/ml，检测限0.014μg/ml，具有很高的灵敏度，而且准确度高、重复性好、检测时间短，为产品研发和生产过程提供了更加简便、稳定、可靠的分析检测方法。
4、附图说明
[0037]
图1为实施例1中的系统适用性试验图谱。
[0038]
图2为实施例1中的供试品溶液试验图谱。
[0039]
图3为实施例3中的方法准确度试验图谱。
[0040]
图4为实施例5中的线性试验图谱。
[0041]
图5为实施例7中的方法重复性试验图谱。
[0042]
图6为实施例8中的不同色谱柱试验图谱。
[0043]
图7为实施例8中的不同柱温试验图谱。
[0044]
图8为实施例8中的不同乙腈比例试验图谱。
[0045]
图9为实施例8中的不同流动相ph值试验图谱。
5、具体实施方式
[0046]
为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面详细描述本发明的具体实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0047]
仪器及色谱条件
[0048]
仪器：waters e2695高效液相色谱仪，紫外检测器。
[0049]
试剂：醋酸铵和冰醋酸均为分析纯，乙腈为色谱级。
[0050]
拉考沙胺对照品及对映异构体对照品均为申请人自制。
[0051]
色谱柱：硅胶表面涂覆纤维素-三-(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱，
[0052]
daicel chiralcel oz-rh 150mm
×
4.6mm，5μm；
[0053]
流动相：0.01mol/l的醋酸铵溶液(用冰醋酸调节ph值至5.8)-乙腈(75∶25)；
[0054]
流速：0.5ml/min；
[0055]
柱温：30℃；
[0056]
检测波长：210nm；
[0057]
进样体积：10μl；
[0058]
溶液配制
[0059]
系统适用性溶液的配制：取拉考沙胺及其对映异构体各适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中各约含0.01mg的溶液。
[0060]
供试品溶液的配制：取本品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含拉考沙胺0.1mg的溶液，作为供试品溶液。
[0061]
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相定量稀释制成每1ml中约拉
考沙胺0.15μg的溶液，作为对照溶液。
[0062]
灵敏度溶液的配制：取供试品溶液适量，用流动相稀释制成每1ml中约含拉考沙胺0.05μg的溶液。
[0063]
测定法
[0064]
取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序拉考沙胺与对映异构体，两者的分离度应不低于1.5；灵敏度溶液色谱图中，主成分峰峰高的信噪比应不小于10。精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有与对映异构体保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.15％)。
[0065]
实施例1专属性试验
[0066]
取系统适用性溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1和图1，系统适用性溶液色谱图中拉考沙胺与对映异构体依次出峰，两者之间的分离度大于1.5，分离良好；拉考沙胺主峰保留时间适中(约8.5分钟)，理论板数大于3000，峰形良好。取灵敏度溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表1，主成分峰峰高的信噪为25，大于10。精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表1和图2，供试品溶液的色谱图中对映异构体未检出，符合要求。
[0067]
表1拉考沙胺对映异构体检查系统适用性试验结果
[0068][0069][0070]
实施例2色谱条件的选择
[0071]
将本品对映异构体系统适用性试验溶液采用高效液相色谱进行检测分析。液相色谱条件：chiralcel oz-rh(150mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱，流动相见表2，紫外检测波长210nm，流速0.5ml/min，柱温30℃，进样量10μl，记录色谱图。
[0072]
表2拉考沙胺对映异构体检查色谱条件的选择
[0073][0074]
由表2色谱条件的筛选结果和实施例表1结果可知，实施例1的流动相及色谱条件，两峰峰型良好，保留时间合适，且拉考沙胺峰与拉考沙胺对映异构体峰之间的分离达到了较好的效果。
[0075]
实施例3准确度试验
[0076]
方法的准确度通过考察样品中加入不同量的对映异构体的准确度来实现的。考察对映异构体的浓度包括定量限浓度、0.075μg/ml的对映异构体(0.075％)、0.15μg/ml的对映异构体(0.15％)、0.225μg/ml的对映异构体(0.225％)。每个浓度重复3次，回收率平均值均符合100
±
20％，相对标准偏差≤10％，方法准确度良好，结果见表3及图3。
[0077]
准确度由测得量/加入量
×
100％计算所得。
[0078]
表3拉考沙胺对映异构体准确度试验结果
[0079][0080]
实施例4溶液稳定性试验
[0081]
配制供试品溶液、对照溶液，室温自然光下放置，分别于0、2、4、6、8、24小时时进样检测，与0小时比较，计算峰面积或对映异构体量的变化值，均不大于10％，测定溶液在24小时内稳定性良好，结果见表4～表5。
[0082]
表4拉考沙胺对映异构体检查对照溶液稳定性试验结果
[0083][0084]
表5拉考沙胺对映异构体检查供试品溶液稳定性试验结果
[0085][0086]
实施例5线性试验
[0087]
方法的线性通过考察至少6个不同浓度溶液的线性来实现。以测得的峰面积对浓度作曲线，用最小二乘法计算回归方程、相关系数及截距，方法线性良好，结果见表6及图4。
[0088]
表6拉考沙胺对映异构体线性试验结果
[0089][0090][0091]
实施例6定量限与检测限试验
[0092]
取拉考沙胺、拉考沙胺对映异构体各适量，用流动相溶解并逐步稀释，摇匀，精密
量取10μl注入液相色谱仪，至测得各成分峰的响应值约为噪音信号的10倍高和3倍高，即为相应成分的定量限和检测限。结果见表7。
[0093]
表7拉考沙胺对映异构体定量限及检测限结果表
[0094][0095]
实施例7精密度试验
[0096]
通过方法重复性和中间精密度两项来进行精密度试验。方法重复性通过重复配制同一批供试品6次(按0.15％量加入对映异构体)，计算每份供试品溶液中对映异构体检出量及检出量的相对标准偏差，rsd不超过10％；中间精密度通过不同的分析人员、在不同的日期、用不同的仪器来重复进行“方法重复性”验证，rsd不超过10％；并且方法重复性和中间精密度的结果的相对偏差不超过10％，符合要求。结果见表8及图5。
[0097]
表8拉考沙胺对映异构体检查精密度试验结果
[0098][0099]
实施例8耐用性试验
[0100]
通过改变色谱柱批号、柱温、流动相比例、流动相ph值等参数来考察测试方法的耐用性。每次测试仅改变其中一个参数，其结果与不改变参数时的测定结果进行比较。与标准条件相比，改变色谱柱批号、柱温变化
±
5℃、流动相中乙腈比例变化
±
2％、流动相ph值变化
±
0.2，拉考沙胺与对映异构体色谱峰之间的分离度均大于1.5，均符合所有系统适用性试验要求，供试品中对映异构体均未检出，表明方法的耐用性良好。结果见表9及图6～图9。
[0101]
表9拉考沙胺对映异构体检查耐用性试验结果
[0102]