一种检测维生素D的代谢物的液相色谱质谱联用的方法和试剂盒与流程

本发明涉及维生素的检测，具体地，涉及一种检测维生素d的代谢物的液相色谱质谱联用的方法和试剂盒。

背景技术：

1、维生素d为固醇类衍生物，是一种可防止佝偻病的脂溶性维生素，最主要的是维生素d3与d2。维生素d3(又称“胆钙化醇”)是由人体皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射转化而来，因其与阳光关系密切，故又称“阳光维生素”，这个途径是人体维生素d的主要来源。维生素d2(又称“麦角钙化醇”)是由植物中的麦角醇经紫外线照射后转化而来，植物性食物(如谷类、蔬菜和水果)中的维生素d2含量很低。

2、维生素d在皮肤内合成或被摄入后，通过肝脏代谢转变为25-羟基维生素d，主要包括25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d2。25-羟基维生素d在肾脏和其他组织中转变为具有生物活性的1,25-双羟基维生素d，该物质经过维生素d结合蛋白转运至靶器官，与维生素d受体结合，从而发挥其生理作用。1,25-双羟基维生素d在人体内的浓度低(pg/ml级别)、半衰期短，检测难度较大，而25-羟基维生素d因其浓度高、稳定、半衰期较长，被作为判断机体维生素d营养状况的主要依据。3-epi-25-羟基维生素d3是25-羟基维生素d3的同分异构体，但没有生物活性，两者质荷比一致而无法通过质谱直接区分，在检测中可通过色谱分离的方式使这两个化合物具有不同保留时间。在学龄儿童体内，3-epi-25-羟基维生素d3占25-羟基维生素d的比例为2.5％～17％，在成人中占比偶尔可高达22％，因此有必要分别对3-epi-25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d3进行定量检测，以排除无生物活性的3-epi-25-羟基维生素d3对判断机体维生素d营养状况的干扰。

3、液相色谱质谱联用法(lc-ms/ms)是临床生化小分子检测的首选方法，具有高灵敏度、高特异性、线性范围宽等优势，目前被广泛用于25-羟基维生素d2和25-羟基维生素d3的检测，且已有相关的试剂盒产品上市销售。3-epi-25-羟基维生素d3作为25-羟基维生素d3的同分异构体，无法通过质谱直接区分，且无法通过常用的c18色谱柱实现分离。然而，现有的检测25-羟基维生素d的lc-ms/m试剂盒均配备c18色谱柱，无法实现3-epi-25-羟基维生素d3和25-羟基维生素d3的分离，不可避免地将无活性的3-epi-25-羟基维生素d3计入到有活性的25-羟基维生素d3测定结果中，从而对判断机体维生素d营养状况的产生干扰。此外，现有的测定25-羟基维生素d的lc-ms/ms方法和试剂盒均采用复杂的衍生化方法，操作较为繁琐，这不仅增加了检测成本，也降低了检测效率。

4、因此，迫切需要开发一种可同时测定25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和3-epi-25-羟基维生素d3的液相色谱质谱联用法检测试剂盒，使其克服现有试剂盒和方法的不足，从而使临床上使用lc-ms/ms法检测25-羟基维生素d的结果更加准确和可靠，为判断机体维生素d营养状况提供有力支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测维生素d的代谢物的液相色谱质谱联用的方法和试剂盒，本发明能同时检测维生素d的代谢物：25-羟基维生素d3、25-羟基维生素d2和3-epi-25-羟基维生素d3。

2、本发明的第一个目的是提供一种检测维生素d的代谢物的液相色谱质谱联用的方法。

3、本发明的第二个目的是提供一种检测维生素d的代谢物的液相色谱质谱联用的试剂盒。

4、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

5、本发明要求保护一种检测维生素d的代谢物的液相色谱质谱联用的方法，包括以下步骤：

6、s1.将待测样品与同位素内标溶液混合，加入沉淀剂，混匀后加入萃取剂，充分萃取；

7、s2.分层后转移上清液，干燥，加入复溶剂充分复溶，固液分离，获取上清液；

8、s3.基于液相色谱质谱联用法采用液相色谱柱对上清液中的待测物进行分离，然后导入质谱分析器中进行检测；

9、其中，所述沉淀剂为：甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈中的一种或几种的混合物，

10、所述萃取剂为：氯仿、正己烷、石油醚或乙酸乙酯中的一种或几种的混合物；

11、所述复溶剂为：甲醇水溶液；

12、所述维生素d的代谢物为25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和3-epi-25-羟基维生素d3的一种或几种。

13、优选地，所述复溶剂为：甲醇体积比20％～100％的甲醇水溶液。

14、更优选地，所述复溶剂为：甲醇体积比80％的甲醇水溶液。

15、优选地，萃取剂为正己烷。

16、优选地所述同位素内标溶液含有25-羟基维生素d2-d3、25-羟基维生素d3-d3和/或3-epi-25-羟基维生素d3-d3。

17、更优选地，所述同位素内标溶液中25-羟基维生素d2-d3、25-羟基维生素d3-d3和/或3-epi-25-羟基维生素d3-d3的浓度为50ng/ml～150ng/ml。

18、再优选地，所述同位素内标溶液中25-羟基维生素d2-d3、25-羟基维生素d3-d3和/或3-epi-25-羟基维生素d3-d3的浓度为100ng/ml。

19、优选地，所述沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶液。

20、更优选地，沉淀剂为甲醇和乙腈按体积比1：(0.5～2)混合的溶液。

21、再优选地，沉淀剂为甲醇和乙腈按体积比1:1混合的溶液。

22、优选地，待测样品、沉淀剂和萃取剂的体积比为1：(1～5)：(2～10)；

23、更优选地，待测样品、沉淀剂和萃取剂的体积比为1：2：6。

24、优选地，所述的复溶剂与样品的体积比为(0.5～3)：1。

25、更优选地，所述的复溶剂与样品的体积比为0.5：1。

26、优选地，步骤s3中，液相色谱柱为苯基柱。

27、更优选的，所述液相色谱柱为五氟苯基柱。

28、作为一个具体的实施例，所述液相色谱柱为phenomenex kinetex f5。

29、优选地，所述待测样品为血清样品。

30、更优选地，所述待测样品为人血清样品、牛血清样品、大鼠血清样品、小鼠血清样品、兔血清样品、牛血清样品。

31、优选地，步骤s3中，所述液相色谱质谱联用法的液相条件为：

32、使用的流动相由以下流动相a和流动相b组成：

33、所述流动相a为体积比为1:(500～2000)的流动相添加剂与超纯水混合物，

34、所述流动相b为体积比为1:(500～2000)的流动相添加剂与甲醇混合物；

35、所述的流动相添加剂为甲酸、乙酸、丙酸、或丁酸中的一种或几种的混合。

36、更优选的，所述流动相添加剂为甲酸。

37、更优选的，所述流动相a为体积比为1:1000的流动相添加剂与超纯水混合物。

38、更优选的，所述流动相b为体积比为1:1000的流动相添加剂与甲醇混合物。

39、优选地，步骤s3中，所述液相色谱质谱联用法的液相条件为：

40、按如下体积比梯度进行洗脱：

41、0到6分钟：流动相a 20％，流动相b 80％；

42、6.1到8分钟：流动相a 3％，流动相b 97％；

43、8.1到10分钟：流动相a 20％，流动相b 80％。

44、优选地，所述液相色谱质谱联用法的液相条件为：进样量：10μl。

45、优选地，所述液相色谱质谱联用法的液相条件为：流速：0.3ml/min。

46、更优选地，所述液相色谱质谱联用法的液相条件为：流速：0.3ml/min，收集进样后4.5到6.0min的色谱流出物导入质谱分析器中进行检测。

47、优选地，步骤s3中，所述液相色谱质谱联用法的质谱条件为：

48、待测物为25-羟基维生素d2，母离子413.5m/z，子离子355.5m/z，去簇电压dp 95v，碰撞电压ce 14v

49、待测物为25-羟基维生素d3，母离子401.5m/z，子离子257.5m/z，去簇电压dp 90v，碰撞电压ce 20v

50、待测物为3-epi-25-羟基维生素d3，母离子401.5m/z，子离子257.5m/z，去簇电压dp 110v，碰撞电压ce 20v

51、待测物为25-羟基维生素d2-d3，母离子416.5m/z，子离子358.5m/z，去簇电压dp100v，碰撞电压ce 35v

52、待测物为25-羟基维生素d3-d3，母离子404.5m/z，子离子257.5m/z，去簇电压dp95v，碰撞电压ce 20v

53、待测物为3-epi-25-羟基维生素d3-d3，母离子404.5m/z，子离子257.5m/z，去簇电压dp 100v，碰撞电压ce 20v

54、优选地，步骤s3中，所述液相色谱质谱联用法的质谱条件为：

55、离子模式：正模式；

56、电喷雾电压：5500v；

57、加热气温度：500℃；

58、雾化气压力：50psi；

59、气帘气压力：30psi；

60、碰撞气压力：10psi；

61、碰撞气：高纯氮气。

62、本发明还要求保护一种检测维生素d的代谢物的液相色谱质谱联用的试剂盒，含有同位素内标溶液、沉淀剂、萃取剂、复溶剂和流动相添加剂的一种或几种：

63、所述沉淀剂为：甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈中的一种或几种的混合物，

64、所述萃取剂为：氯仿、正己烷、石油醚或乙酸乙酯中的一种或几种的混合物；

65、所述复溶剂为：甲醇水溶液；

66、所述同位素内标溶液含有25-羟基维生素d2-d3、25-羟基维生素d3-d3和/或3-epi-25-羟基维生素d3-d3；

67、所述的流动相添加剂为甲酸、乙酸、丙酸、或丁酸中的一种或几种的混合；

68、所述维生素d的代谢物为25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和3-epi-25-羟基维生素d3的一种或几种。

69、优选地，所述复溶剂为：甲醇体积比20％～100％的甲醇水溶液。

70、更优选地，所述复溶剂为：甲醇体积比80％的甲醇水溶液。

71、优选地，所述同位素内标溶液中25-羟基维生素d2-d3、25-羟基维生素d3-d3和/或3-epi-25-羟基维生素d3-d3的浓度为50ng/ml～150ng/ml。

72、更优选地，所述同位素内标溶液中25-羟基维生素d2-d3、25-羟基维生素d3-d3和/或3-epi-25-羟基维生素d3-d3的浓度为100ng/ml。

73、优选地，沉淀剂为甲醇和乙腈按体积比1：(0.5～2)混合的溶液。

74、更优选地，沉淀剂为甲醇和乙腈按体积比1:1混合的溶液。

75、优选地，萃取剂为正己烷。

76、优选地，流动相添加剂为甲酸。

77、优选地，还含有液相色谱柱，色谱柱为苯基柱。

78、更优选的，所述液相色谱柱为五氟苯基柱。

79、作为一个具体的实施例，所述液相色谱柱为phenomenex kinetex f5。

80、优选地，还含有校准品和/或质控品。

81、更优选地，所述对校准品和/或质控品含有25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和/或3-epi-25-羟基维生素d3。

82、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

83、本发明首次开发了一种可同时测定25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和3-epi-25-羟基维生素d3的液相色谱质谱联用法检测试剂盒。待测样本经过蛋白沉淀、萃取、氮气吹干、复溶后，使用色谱柱分离待测物，使用串联质谱仪进行检测。本方法无需衍生化，操作简单，用时较短，并且可在一次检测中同时测定25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3和3-epi-25-羟基维生素d3的浓度，检测结果准确可靠。