用于检测PEDV的免疫生物传感器及其制备方法和应用

用于检测pedv的免疫生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及病原快速检测领域，特别是涉及一种用于检测pedv的免疫生物传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)是ped的主要病原体，是一种有囊膜的rna病毒，属于冠状病毒科、α冠状病毒属的成员。pedv可感染许多年龄段的猪，但主要引起新生仔猪出现腹泻、呕吐、厌食、脱水和体重减轻等症状，7日龄以下仔猪病死率甚至可达100%。pedv于1978年由pensaert等于比利时首次分离，随后传播至许多国家及地区，并造成了严重经济损失，目前对于pedv主要的防控手段为接种疫苗，由于缺乏相应的治疗药物，因此，及时地检测pedv是防控该病的前提和基础。建立一种快速、准确、易操作、成本低廉的检测方法将有利于在生产实践中及早诊断和控制该病的流行。
3.目前，目前用于pedv的检测的方法主要包括病毒分离鉴定、实时荧光定量pcr（quantitative real-time pcr，qpcr）、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，elisa）等。
4.病毒分离鉴定是最为准确、可靠的病毒检测方法，是病毒检测的“金标准”，也是最早出现的病毒检测方法。该方法首先采集病料，并使用细胞或鸡胚进行病毒培养分离，随后对病毒进行毒力测定、理化性质测定等以确诊病毒。该方法检测的准确率高，但检测周期长，操作繁琐、成本高昂，且对操作人员的素质有着较高的要求，不适用于实际生产中的大范围应用及推广。
5.实时荧光定量pcr（quantitative real-time pcr，qpcr）具有灵敏性高、检测时间短等的特点，其基本原理是在体外核酸扩增过程中，加入可插入核酸序列中的荧光物质，随着扩增的不断进行，荧光物质的数量不断增加，通过荧光信号的强弱以检测病毒的数量。该方法是目前使用最广泛的方法之一，相较于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr），其进一步地提高了灵敏性，高效且省时，但其检测设备及试剂较为昂贵，且容易污染出现假阳性的结果，对操作人员的素质要求高。
6.酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，elisa）具有操作简便、试验条件要求较低的特点，而被广泛应用于数量较多的样品的检测。其基本原理是利用抗原抗体的特异性结合，预先在固相载体上固定抗原，或抗体，在抗原抗体结合后通过肉眼观察沉淀或使用酶标仪来判定检测结果。elisa相较于qpcr等的分子生物学诊断方法成本较低，对于试验条件要求较低，操作简单。但其检测的灵敏度较差，孵育时间长等缺点。


技术实现要素：

7.针对上述技术问题，本发明提供一种用于检测pedv的免疫生物传感器，该免疫生物传感器针对pedv的检测具有优异的灵敏性、精确性和特异性。
8.为了达到上述目的，本发明提供了一种用于检测pedv的免疫生物传感器，该免疫
生物传感器包括电极基材、氧化石墨烯层、壳聚糖层、猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层；所述氧化石墨烯层、所述壳聚糖层、所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层依次层叠覆盖于所述电极基材。
9.免疫生物传感器具有制备成本低、操作简单等特点，仅需简单的培训后即可使用，更适用于实际生产中的应用。因此，本发明人为利用抗原抗体特异性结合的特点，对pedv进行检测，在工作电极上固定修饰材料以提高传感器检测性能，随后在工作电极上固定抗体，通过抗原抗体结合后传感器检测的电流变化以进行检测。
10.不仅如此，本发明人采用氧化石墨烯/壳聚糖作为电极的修饰材料。石墨烯（graphene，gr）由于其具有比表面积大、热导率高、力学性能好和电荷迁移率高等优异的物理化学性质，从而在电化学催化、电化学分析等领域已得到了广泛的关注。但由于gr会发生不可逆的团聚现象，从而限制使其在电化学各领域的应用。氧化石墨烯（graphene oxide，go）是gr的一种重要衍生物，也可看作是一种典型的功能化gr，其结构与gr非常相似，而go制备简单、易得，且具有良好的亲水特性，可弥补gr的不足。
11.壳聚糖（chitosan，cs）具有来源丰富、价格便宜、无毒性、良好的生物相容性、生物降解性及抗菌性能等特点。在其分子链中含有的大量氨基，可通过ph的变化发生溶胶-凝胶转变，使其在阴极表面通过自组装成为水凝胶，当施加一定电压或电流时，在电极表面会发生电化学反应，在阴极处由于水的电化学反应产生oh
−
或消耗h
+
，导致阴极表面产生局部较高的ph梯度，溶液中阴极附近的cs分子由于阴极表面产生的局部高ph而发生溶胶-凝胶转变，在阴极表面形成cs凝胶。
12.在其中一个实施例中，所述电极基材为玻碳电极。
13.本领域常用的电化学电极主要有圆盘电极（玻碳电极、金电极、铂电极）、氧化铟锡电极（ito电极）、丝网印刷电极（丝网印刷碳电极、丝网印刷金电极、丝网印刷镍电极等）以及叉指阵列微电极等。而本发明人选择的玻碳电极（glassy carbon electrode, gce）具有较好的导电性，较高的化学稳定性，且热胀系数小、质地坚硬、气密性好，其可制成圆柱、圆盘等电极形状，用它作基体还可制成汞膜玻碳电极和化学修饰电极等。本发明中采用gce作为传感器的工作电极，可较好的提高传感器的灵敏性，且gce性状稳定、便于储存，相较于其他类型的工作电极，其价格相对低廉，使用广泛。
14.在其中一个实施例中，所述免疫生物传感器还包括：覆盖于所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层表面的牛血清蛋白封闭层。
15.通过利用牛血清蛋白溶液封闭电极上多余的非特异性活性位点，使该免疫生物传感器具有较好的特异性。
16.本发明还提供了一种用于检测pedv的免疫生物传感器的制备方法，包括以下步骤：制备氧化石墨烯层：通过电化学还原法使氧化石墨烯沉积于电极基材表面，形成氧化石墨烯层；制备壳聚糖层：通过电化学沉积法使壳聚糖沉积于所述氧化石墨烯层表面，形成壳聚糖层；制备猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层：将猪流行性腹泻病毒单克隆抗体滴涂至壳聚糖层表面，孵育，形成猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层，得到用于检测pedv的免疫生物传
感器。
17.现有技术中，将氧化石墨烯（go）固定至电极上的方法，通常采用滴涂法，即将制备好的go或功能化go，如还原型氧化石墨烯（reduced graphene oxide, rgo），滴涂至电极表面，待其干燥后即完成对电极的修饰，该法操作简单，但其需较长的干燥时间，且无法精确控制电极表面的石墨烯层数。不仅如此，氧化石墨烯（go）结构中富含的各种含氧基团会导致go修饰界面的电子传输能力降低，而限制其在电化学传感器方面的应用。
18.而本发明人在研究过程中发现采用适当的还原方法可减少和控制go表面的含氧基团的数量，以恢复其较为完善的平面共轭结构，从而提高其导电性和调节带隙，从而达到调控材料电催化性能的目的。因此，本发明人采用电化学还原法将氧化石墨烯沉积于电极基材表面，该法具有制备过程简单、快速，工艺绿色、环保，还原程度高效、可控，无副产物及杂质的引入等优势。且电化学沉积法具有良好的重现性，在电极表面沉积得到的产物为电化学还原型氧化石墨烯（electrochemical reduced graphene oxide, ergo），可稳定提高电极的导电性。且通过对沉积时间的控制，可精确控制电极表面沉积的层数，从而控制修饰材料对电极导电性的影响。此外，本发明中所用的沉积方法用时较短，仅需五分钟左右即可完成对电极的修饰，且无需额外操作，即可将go转化为ergo并沉积至电极上。
19.同时，壳聚糖（cs）具有ph刺激响应性，可通过电化学反应进行沉积，采用电化学沉积技术，使沉积过程具有时间和空间选择性和可控性，能够实现cs在特定的区域进行沉积及同其他物质的共沉积，能够通过电沉积制备具有不同厚度、层数的cs水凝胶。cs价格便宜、无毒性、具有良好的生物相容性，可与ergo产生良好的协同作用，一方面保留了ergo良好导电性，另一方面也保留了cs良好的生物相容性，更有利于抗体在cs上的固定。类似于go的电化学沉积，相对于滴涂法，电化学沉积cs能形成均一，且厚度可控的膜，防止过厚的cs膜影响传感器的导电性，又防止过薄的cs膜不利于抗体的附着。
20.本发明的两种主要的修饰材料都采用了电化学沉积，可同时精准控制传感器最终的检测能力，通过确定ergo与cs各自在电极上最佳沉积厚度配比，可使两者发挥最大程度的协同作用，进而影响传感器最终的检测能力。在确定本发明中两种关键修饰材料沉积条件的基础上，通过控制抗体固定量及抗体交联剂的最佳配比，从而直接影响传感器的最低检测限。
21.在其中一个实施例中，所述猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的浓度为200ng/μl。
22.固定的抗体作为生物传感器识别抗原的核心元件，其在电极表面负载的量的多少会直接影响传感器的检测能力。较高的抗体负载量，可提高传感器的灵敏性，但当在电极表面的抗体过饱和后，又会影响抗体的有效利用率，且极大的增加了传感器的制备成本。电极上可负载的抗体量与电极表面修饰材料、选用的抗体固定方法、抗体固定时的缓冲体系、温度等多方面因素相关。本发明人经过大量试验后发现，采用edc/nhs作为交联剂，将抗体溶于pbs中，冰上孵育的条件下，200ng/μl的浓度有较好的检测限。
23.在其中一个实施例中，所述制备猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层步骤还包括：滴涂流行性腹泻病毒单克隆抗体之前，将电极基材在n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的混合溶液中浸泡40-60min。
24.采用上述混合溶液进行化学耦联具有以下优势：1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide,edc]属于碳化二亚胺类化学
耦联剂，edc能活化羧基使其能与蛋白、肽、抗体及具有氨基的小分子反应形成稳定的共价酰胺键。但是，edc介导的耦联反应中形成的中间体o-酰基脲不稳定，易水解，因此需要在n-羟基琥珀酰亚胺（n-hydroxysuccinimide,nhs）存在下反应形成稳定且具有氨基反应活性的中间体sulfo-nhs酯，再与伯胺反应形成稳定的酰胺键。该化学耦联反应无需在无水的条件下进行，试剂不需要干燥处理，反应时间更短，效率更高，易于操作，无需复杂的设备或仪器，仅需将修饰好的电极浸泡于混合溶液中一段时间，即可完成对电极的活化以固定抗体，且成本低廉、效果确实，具有较好的复现性。
[0025]
在其中一个实施例中，所述制备方法还包括：制备猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层步骤后，将修饰了猪流行性腹泻病毒单克隆抗体层的电极基材与牛血清蛋白孵育，形成牛血清蛋白封闭层。
[0026]
在其中一个实施例中，所述电化学还原法包括以下步骤：将电极基材浸泡于氧化石墨烯分散液中，ph为5.8-6.4，采用循环伏安法以80-120mv/s的扫描速率在-1.5v-0.3v的电位区间内扫描25-35圈。
[0027]
电化学沉积法与传统的滴涂法相比，虽有诸多优点，但其沉积条件难以确定，在沉积过程中诸多沉积条件变量会极大得影响沉积的效果。本发明人在研究过程中发现，氧化石墨烯可在ph2.0~10.0的区间内进行电化学还原为还原型氧化石墨烯，并沉积至电极上，但氧化石墨烯的最适沉积ph值在不同的沉积环境中可能存在差异，本发明人在试验过程中发现随着ph值的升高，氧化石墨烯溶液逐渐出现团聚的现象，从而影响了氧化石墨烯在电极上的沉积效果；另一方面，较低的ph值环境中，氢离子会与go相互竞争电子，从而影响沉积效率，且由于大量气泡的出现，会影响在电极表面的微观结构的形成，两者共同作用影响go的沉积。本发明人经过大量试验，发现弱酸性，即ph 6.4，为较适合的沉积条件，当ph大于6.4时，沉积效果开始下降，超出6.8后或由于go出现团聚而使沉积效果显著下降。
[0028]
同时，本发明人还发现，随着还原时间的延长，go的还原程度就越高，直至其结构中的大多数含氧官能团被去除，其导电性能也随之提高。但由于在还原过程中，go转变为ergo沉积于电极上的层数逐渐增加，其导电性能也会随之降低，所以沉积时间的把控对于控制电极材料的修饰有着关键作用。本发明人经过大量试验，发现当扫描至30个循环后，其电流较扫描20个循环的电极有着明显提升，但40个循环较30个循环的电极提升不显著，30个循环数为效果较好的沉积时间。
[0029]
在其中一个实施例中，所述电化学沉积法包括以下步骤：将修饰了氧化石墨烯的电极基材浸泡于壳聚糖溶液中，采用计时电流法以（-3v）-（-2v）的电位进行沉积250-350s。
[0030]
在其中一个实施例中，所述n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的混合溶液中，所述n-羟基琥珀酰亚胺与所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:4；所述电极基材为玻碳电极。
[0031]
本发明还提供了一种pedv的检测方法，包括以下步骤：将生物样本制成上清液，滴加于所述用于检测pedv的免疫生物传感器，孵育，采用差分脉冲伏安法检测响应电流值，计算得到所述生物样本中pedv的抗原浓度。
[0032]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的一种用于检测pedv的免疫生物传感器及其制备方法和应用，该免疫生物传感器采用氧化石墨烯/壳聚糖作为电极的修饰材料，并采用电化学沉积的方式在电极表
面固定两种修饰材料，将猪流行性腹泻病毒单克隆抗体滴涂至电极表面，并利用牛血清蛋白溶液封闭电极上多余的非特异性活性位点，使最终制备得到的生物传感器具有优异的灵敏性、精确性和特异性。该制备方法采用电化学沉积固定修饰材料的方式，简单高效、成本低廉，相较于其他常见的固定方式，具有重复性好、修饰时间短、修饰效果好的特点，极大地提高了传感器的性能，并在临床病料的检测中与qpcr结果一致。采用该免疫生物传感器检测pedv的方法，适用于在非实验室中对于猪流行性腹泻病毒的临床检测，根据差分脉冲伏安法中测定的响应电流值，可对生物样本中的猪流行性腹泻病毒抗原进行定性定量检测。
附图说明
[0033]
图1为实施例1中免疫生物传感器的工作原理图；图2为实施例1中go电化学还原沉积cv曲线图；图3为实施例1中免疫生物传感器各修饰阶段cv曲线图；图4为实施例2中不同浓度pedv孵育后dpv曲线图；图5为实施例2中不同浓度pedv孵育后峰值电流与抗原浓度标准曲线图；图6为实施例2中不同扫描次数间峰值电流图；图7为实施例2中不同抗原测定后免疫生物传感器的峰值电流图；图8为实验例中不同ph值的cv曲线图；图9为实验例中不同浓度抗体的dpv曲线图。
具体实施方式
[0034]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0035]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
[0036]
定义：本发明所述的dpv：指差分脉冲伏安法。
[0037]
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
[0038]
实施例1制备用于检测pedv的免疫生物传感器，该免疫生物传感器的工作原理如图1所示。
[0039]
1、使用粒径0.3 μm的al2o3抛光粉在麂皮将gce表面抛光至镜面后，使用无水乙醇进行超声清洗，而后使用超纯水冲洗后置于室温干燥。采用甘汞电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，gce为工作电极的三电极工作体系。使用含0.1 mol/l-1
kcl、5.0 mmol/l-1
k4[fe (cn)6]、5.0 mmol/l-1
k3[fe (cn)6]的pbs缓冲液（ph7.4）作为测量缓冲液，采用循环伏安法（cv）以100 mv/s的扫描速率在-0.6 ~ 1.2v的电位范围内扫描，记录其cv曲线。
[0040]
2、使用pbs缓冲液配置浓度为1mg/ml的氧化石墨烯（go）分散液，并调节ph至6.4，
取10 ml go分散液并将电极浸泡中，采用cv以100 mv/s的扫描速率在-1.5v ~ 0.3v的电位区间内扫描30圈进行电化学还原（图2），得到还原型氧化石墨烯（rgo）并沉积至gce之上。随着扫描的进行，响应电流逐渐上升，说明rgo已沉积至gce之上。扫描完毕后使用超纯水冲洗电极表面多余的go分散液，并选用与本实施例中步骤1相同的电极工作体系、测量缓冲液及cv参数进行测量，记录其cv曲线。
[0041]
3、使用1%乙酸溶液配置浓度为2mg/ml的壳聚糖（cs）溶液，并调节其ph至6.0。将电极浸泡于10 ml cs溶液中，采用计时电流法（ca）以-2.5 v的电位进行电化学沉积，沉积300s，沉积完成后使用超纯水冲洗电极表面多余的cs溶液，并置于室温干燥。选用与本实施例中步骤1中相同的电极工作体系、测量缓冲液及cv参数进行测量，记录其cv曲线。
[0042]
4、使用超纯水配置100 mm n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）及400 mm 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（edc
·
hcl）的混合溶液作为交联剂。将电极浸入溶液中活化50 min用于抗体的固定。随后滴加10 μl 200 μg/ml pedv n蛋白单克隆抗体至电极表面，置于37
°
c中孵育50 min。孵育完毕后，选用与本实施例中步骤1相同的电极工作体系、测量缓冲液及cv参数进行测量，记录其cv曲线。
[0043]
5、使用ph7.4的pbs溶液配置30 mg/ml牛血清蛋白（bsa）溶液，将电极置于2 ml bsa溶液中浸泡，置于37℃中孵育50 min。孵育完成后，使用0.05% tween-20的磷酸盐缓冲液（pbst）冲洗电极，以洗去电极表面多余的bsa溶液，随后选用与本实施例中步骤1相同的电极工作体系、测量缓冲液及cv参数进行测量，记录其cv曲线，并与上述1~4所得的各修饰阶段的cv曲线进行比较，结果如图3所示，其中rgo-cs-ab-bsa-ag中的ag为pedv抗原，为采用实施例1制备得到的免疫生物传感器（rgo-cs-ab-bsa）检测病原pedv后的cv曲线。rgo沉积后，相较于未修饰的gce，其响应电流上升，说明rgo已沉积至电极上，并可提高gce的导电性。随着电极进一步修饰，响应电流出现逐渐下降，说明修饰材料已固定至gce之上，并影响了gce的导电性。而免疫生物传感器（rgo-cs-ab-bsa）检测病原pedv后的cv曲线出现了明显的电流下降，证明本实施例的免疫生物传感器（rgo-cs-ab-bsa）可用于检测pedv。
[0044]
实施例2将实施例1的免疫生物传感器用于pedv检测的方法。
[0045]
1、灵敏性实验：采用若干个实施例1制备得到的免疫生物传感器（rgo-cs-ab-bsa），分别在免疫生物传感器的电极上滴加20 μl pedv抗原浓度10
6.059
、10
5.059
、10
4.059
、10
3.059
、10
2.059
、10
1.059 copies/μl的pbs缓冲液中，并使用同体积pbs缓冲液作为空白对照，置于37
°
c中孵育50 min。孵育完成后使用pbst缓冲液冲洗电极以去掉其表面未结合的抗原，随后使用与实施例1中相同的电极工作体系、测量缓冲液，采用dpv测定不同pedv抗原浓度的电极在孵育后的响应电流值（图4）。在抗原浓度为10
2.059 copies/ml处响应电流出现了显著下降，所以传感器的最低检测限（lod）为10
1.059 copies/ml。将峰值电流（i，μa）与抗原浓度（c，copies/μl）绘制标准曲线（图5），峰值电流在10
1.059 copies/μl ~ 10
6.059 copies/μl间呈线性关系，标准方程为i =
ꢀ‑
31.16 logc + 277.08，相关系数（r2）为0.9935。
[0046]
2、重复性实验：使用与实施例1中相同的电极工作体系、测量缓冲液，采用dpv连续测定与pedv抗原结合后的传感器的响应电流，并记录、比对第1、3、5、7、9、11次的峰值电流（图6）。计算其相对标准偏差（rsd）为0.384%。
[0047]
3、特异性实验：选择prrsv抗原、csfv抗原、jev抗原、prv抗原作为对照组，使用与
实施例1中相同的电极工作体系、测量缓冲液，采用dpv测定不同抗原结合后的传感器的响应电流值，并记录其峰值电流（图7）。结果显示pedv抗原与电极孵育后有显著的响应电流下降，而对照组电流下降不明显。
[0048]
实施例3将实施例1的免疫生物传感器应用于pedv临床检测。
[0049]
1、分别选取不同病猪的肠组织进行充分研磨，并使用无菌pbs缓冲液（ph7.4）进行稀释溶解，反复冻融3次后在5000 r/min的转速条件下进行离心10 min，而后取上清液，并分装于无菌离心管中置于4
°
c冰箱保存。
[0050]
2、使用实时荧光定量pcr（qpcr），测定各临床样品的抗原浓度。
[0051]
3、采用若干个实施例1的免疫生物传感器，随后分别在免疫生物传感器的电极上滴加20 μl的临床样品上清液，于37
°
c中孵育50 min。孵育完成后使用pbst缓冲液冲洗电极，使用与实施例1中相同的电极工作体系、测量缓冲液，采用dpv测定各临床样品的电极在孵育后的响应电流值。并根据其峰值电流通过标准方程计算出相应的抗原浓度，并与qpcr结果进行对比，结果如下表所示。结果表明，免疫生物传感器的测定结果与qpcr的测定结果间有着较好的一致性。
[0052]
表1 免疫生物传感器与qpcr的检测结果对比样品编号组织来源qpcr测定（copies/μl）免疫生物传感器测定一致性1空肠8.45
×
107+是2空肠7.41
×
106+是3空肠9.70
×
106+是4回肠2.16
×
107+是5回肠4.56
×
107+是6回肠9.78
×
106+是对比例1一种用于检测pedv的免疫生物传感器。
[0053]
该免疫生物传感器的制备方法和实施例1基本相同，区别之处在于，实施例1的第2步中，使用pbs缓冲液配置浓度为1mg/ml的氧化石墨烯（go）分散液后，调节ph至6.8。
[0054]
对比例2一种用于检测pedv的免疫生物传感器。
[0055]
该免疫生物传感器的制备方法和实施例1基本相同，区别之处在于，实施例1的第2步中，使用pbs缓冲液配置浓度为1mg/ml的氧化石墨烯（go）分散液后，调节ph至7.0。
[0056]
对比例3一种用于检测pedv的免疫生物传感器。
[0057]
该免疫生物传感器的制备方法和实施例1基本相同，区别之处在于，实施例1的第2步中，使用pbs缓冲液配置浓度为1mg/ml的氧化石墨烯（go）分散液后，调节ph至7.2。
[0058]
对比例4一种用于检测pedv的免疫生物传感器。
[0059]
该免疫生物传感器的制备方法和实施例1基本相同，区别之处在于，实施例1的第4步中，将电极浸入溶液中活化50 min用于抗体的固定，采用10 μl pbs溶液替代pedv n蛋白
单克隆抗体，滴加至电极表面，置于37
°
c中孵育50 min。
[0060]
对比例5一种用于检测pedv的免疫生物传感器。
[0061]
该免疫生物传感器的制备方法和实施例1基本相同，区别之处在于，实施例1的第4步中，将电极浸入溶液中活化50 min用于抗体的固定，然后滴加10 μl 50 μg/ml pedv n蛋白单克隆抗体至电极表面，置于37
°
c中孵育50 min。
[0062]
对比例6一种用于检测pedv的免疫生物传感器。
[0063]
该免疫生物传感器的制备方法和实施例1基本相同，区别之处在于，实施例1的第4步中，将电极浸入溶液中活化50 min用于抗体的固定，然后滴加10 μl 100 μg/ml pedv n蛋白单克隆抗体至电极表面，置于37
°
c中孵育50 min。
[0064]
对比例7一种用于检测pedv的免疫生物传感器。
[0065]
该免疫生物传感器的制备方法和实施例1基本相同，区别之处在于，实施例1的第4步中，将电极浸入溶液中活化50 min用于抗体的固定，然后滴加10 μl 150 μg/ml pedv n蛋白单克隆抗体至电极表面，置于37
°
c中孵育50 min。
[0066]
对比例8一种用于检测pedv的免疫生物传感器。
[0067]
该免疫生物传感器的制备方法和实施例1基本相同，区别之处在于，实施例1的第4步中，将电极浸入溶液中活化50 min用于抗体的固定，然后滴加10 μl 250 μg/ml pedv n蛋白单克隆抗体至电极表面，置于37
°
c中孵育50 min。
[0068]
实验例1、将实施例1、对比例1-3制备得到的免疫生物传感器，选用与本实施例中步骤1相同的电极工作体系、测量缓冲液及cv参数进行测量，记录其cv曲线，并进行比较，结果如图8所示。
[0069]
2、将实施例1、对比例4-8制备得到的免疫生物传感器，选用与本实施例中步骤1相同的电极工作体系、测量缓冲液及cv参数进行测量，采用dpv测定响应电流值，并进行比较，结果如图9所示。
[0070]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0071]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。