一种新型高分辨染色体G显带方法及其应用与流程

本发明属于医学检验，具体是一种新型高分辨染色体g显带方法及其应用。

背景技术：

1、染色体是基因的载体，染色体异常，势必引起基因表达不平衡，从而引起一系列的临床症状。研究表明染色体异常与血液系统疾病、智力低下、生殖异常等密切相关。在人类生殖研究领域，流产、死胎、胎停不孕不育、无精少精、卵巢早衰、幼稚子宫、出生缺陷、第二性征发育不全等疾病与染色体的结构异常、数目异常以及多态性相关，因此对此类患者进行染色体核型分析很有必要。1968年瑞典细胞化学家caspersson等应用荧光染料氮芥喹吖因(qu inacr ine mustard,qm)处理染色体后，在荧光显微镜下可观察到染色体沿其长轴显示出一条条宽窄和亮度不同的横纹，即染色体的显带(band)。随后又出现了其他几种染色体显带技术。显带技术可将人类的染色体显示出各自特异的带纹，称为带型。g带是目前被广泛应用的一种带型，它主要是被姬姆萨(giemsa)染料染色后而显带，故称之为g显带技术，其所显示的带纹分布在整个中期细胞的染色体上。g显带方法简单，带纹清晰，染色体标本可长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

2、常规的g式显带法的实验原理为：g显带是最常用的，染色体经胰蛋白酶处理后，然后用一种能结合dna的化学染料giemsa染色，使染色体呈深浅不同的带型，人类的24种染色体可显示出各自特异的带纹。

3、试验用品包括：

4、光学显微镜、恒温水浴箱、立式染色缸、染色体玻片标本(75摄氏度中烤片3小时，未经染色)、0.5-1m氢氧化钠溶液、0.4％酚红溶液、生理盐水或ph为7.4的1、15m磷酸缓冲液；

5、胰蛋白酶：用生理盐水配成2.5％的贮存液，冰冻保存；

6、giemsa染色液：蒸馏水配成6％浓度，临用前配制。

7、实验方法：

8、1)将50ml生理盐水溶液或ph为7.4的1/15m磷酸缓冲液倒入立式染色缸内；

9、2)取2.5％胰蛋白酶1ml加入100ml生理盐水溶液内混匀，滴入1-2滴1m氢氧化钠溶液至上液中，用0.4％酚红作指示剂，使ph达到7.2～7.4(或取2.5％胰蛋白酶溶液1ml加入100ml ph为7.4的1/15m磷酸缓冲液中)；

10、3)将配置好的胰蛋白酶溶液置37摄氏度水浴箱中预热5分钟；

11、4)取染色体标本片，置入胰蛋白酶溶液中，轻轻摇动60-180秒，立即在生理盐水中漂洗两次。

12、5)以giemsa染色5-10分钟(37摄氏度)后，用自来水冲洗、晾干。

13、镜检判断显带效果，在低倍镜下下选择分散良好，长度适中的分裂相，再转至油镜下观察，若染色体边缘发毛，为显带过度；若染色体未出现带纹，则为显带不足。

14、这时应根据具体情况再试一张标本片，适当增减胰蛋白酶处理的事件，指导满意为止。

15、注意：

16、1)玻片完全干后，才可置油镜下进行观察。

17、2)每次显带均应做预实验处理，以决定正确的显带事件，不可盲目处理所有玻片。

18、3)显带效果的判断：应多观察几个长度适中的分裂相，不能仅凭1-2个分裂相做出判断。

19、然而，临床实践中，常规的g显带方法无法获得较高的分辨率。

20、此外，外周血染色体的制作主要包括:培养、收获、低渗、固定、制片、显带及染色等步骤，每个步骤都可能会影响外周血染色体的制备成功。由于外周血染色体的制作过程复杂，影响因素众多，常常出现可分析分裂相小，染色体粗短，且分散度不良等现象，大大降低了染色体核型分析的成功率，降低了其临床实用性，常规染色体分析对于＜10m碱基的异常很难检出。建立高分辨率染色体分析体系、提高小片段异常检出率，是临床细胞遗传关注的重要问题。因此如何改进流程，提高染色体分带水平尤为重要。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题；为此，本发明提出了一种新型高分辨染色体g显带方法及其应用，高分辨显带技术最终可以获得带纹550及以上的分裂相，可检出更多小片段染色体异常。

2、为实现上述目的，本发明一方面提供了一种新型高分辨染色体g显带方法，包括：接种过程以及收获操作，基于小牛血清培养基、五氟尿嘧啶、尿嘧啶核苷、kh2po4、胸腺嘧啶、kcl低渗液、na2hpo4、溴化乙锭、nacl、胰酶、酚红、秋水仙素、甲醇：乙酸＝3：1的固定剂以及giemsa染色液使得同步化g显带带纹的分辨达到500～550条带。

3、优选的，所述接种过程包括：常规接种0.25-0.3m外周血入高分辨培养基，培养72小时加frdu和尿嘧啶核苷各100μl，17小时后加入tdr 100μl，继续培养4小时后加入溴化乙锭eb 50μl，45分钟后加入秋水仙胺35μl，10分钟后收获；

4、优选的，所述收获操作包括：

5、1)将细胞液移入15ml离心管，1500rpm*10min*rt离心，去掉上清液后，加入室温0.075m kcl低渗液至6-8ml，在室温下低渗40分钟；

6、2)加入1.5ml固定剂，轻柔混匀；

7、3)1500rpm*10min离心，去掉上清液后，加固定液至8ml，轻柔混匀；

8、4)1500rpm*10min离心，去掉上清液后，加固定液至8ml，轻柔混匀；

9、5)1500rpm*10min离心，去掉上清液后，留少许制成细胞悬液，细胞悬液浓度相对普通外周血g低；

10、6)保持60-100cm高滴片，每片滴1-2滴；

11、7)75摄氏度条件下烤片3小时。

12、优选的，所述方法新型高分辨染色体g显带方法的试验用品，包括：

13、4)培养瓶、吸管、洗头、离心管、冰玻片、离心机、显微镜、染缸、烧杯；

14、5)25％的rpmi 1640小牛血清培养基5ml；

15、6)同步化及显带所用试剂：

16、10-3m 5fu(五氟尿嘧啶)；10-4m ur id ine(尿嘧啶核苷)；1/15m kh2po4；

17、10-3m tdr(胸腺嘧啶)；0.075m kcl低渗液；1/15m na2hpo4；

18、1mg/ml eb(溴化乙锭)；0.85％的nacl；2.5％胰酶

19、0.4％酚红；20μg/ml的秋水仙素；

20、4)固定剂：甲醇：乙酸＝3：1；

21、5)giemsa染色液。

22、本发明的第二方面还提供新型高分辨染色体g显带方法在人外周血/脐带血改良同步化淋巴细胞培养方法中的应用。

23、优选的，所述新型高分辨染色体g显带方法在人外周血/脐带血改良同步化淋巴细胞培养方法中的应用适用于外周血和/或脐带血淋巴细胞培养；实验试剂包括：人体外周血淋巴细胞培养基、细胞同步化试剂盒、浓度100μg/ml秋水仙素、0.075mo l/l的kcl溶液作为低渗液、甲醇：冰醋酸＝3：1的卡诺固定液、2.5％胰蛋白酶、giemsa母液、1/15m na2hpo4以及1/15m kh2po4磷酸盐缓冲液。

24、优选的，所述新型高分辨染色体g显带方法在人外周血/脐带血改良同步化淋巴细胞培养方法中的应用包括：

25、1)在细胞接种培养48-56小时后，向每个标本培养瓶中加入0.1ml溶液a，避光培养过夜，处理时间约15-18小时；

26、2)向每个标本培养瓶中加入0.1ml溶液b，细胞培养5小时，无须洗涤细胞；时间是细胞从s期到m期的时间，可根据细胞生长状态进行调整；

27、3)加入2滴100μg/ml秋水仙素溶液，处理30-60分钟，如果需要大量的前中期染色体，可将处理时间缩短为10-15分钟；可以将处理时间固定在15分钟，调整加秋水仙素的量，以达到理想的效果；

28、4)按第一方面的方法制备染色体。

29、本发明的第三方面还提供新型高分辨染色体g显带方法在改良同步化g显带染色体核型分析中的应用。

30、优选的，新型高分辨染色体g显带方法在改良同步化g显带染色体核型分析中的应用包括：

31、临床医生超声的引导下，经腹行胎儿脐静脉穿刺，抽取24周以上孕妇脐带血2ml，分别注入1支无菌bd肝素抗凝管及1支edta抗凝管，其中所述edta抗凝管先用来做母源性污染后进行cma检测；

32、脐带血于当天下午分别接种于ab两线外周血淋巴细胞培养基，其中a线为常规培养法；b线为同步化培养法，每线采用1ml注射器垂直加入的方式加入22滴血,接种后轻轻水平摇动几次混匀，直立于2个独立的37℃恒温培养箱培养72h；

33、在收获前加入20μl的20μg/ml秋水仙素溶液3h后收获，而同步化培养在细胞培养48h后，向培养液中加入0.1ml溶液a，中止dna的合成，使细胞周期停止在s期，避光培养过夜；

34、18h后向培养液中加入0.1ml b溶液,解除溶液a对dna合成的抑制，恢复细胞周期；

35、3h后大部分细胞都处于分裂中期，加入0.1ml 100μg/ml秋水仙素溶液，10min后收获细胞；

36、按照第一方面所述的高分辨染色体g显带方法制备染色体g显带。

37、优选的，溶液a为5-氟尿嘧啶、溶液b为胸腺嘧啶脱氧核苷。

38、本发明的方法和应用具体有益效果如下：

39、(1)常规法g显带带纹的分辨仅达到320～400条带，改良同步化g显带带纹的分辨达到500～550条带。

40、(2)染色体核型分析是诊断染色体病的主要技术手段，染色体越长，条带越多，染色体异常检出率就会增高；采用改良同步化g显带染色体核型分辨率可提高至500～550条带，有利于发现更多的染色体结构异常，提高染色体异常检出率。