基于PEI功能化GO和ROP双信号放大策略的高灵敏cTnI检测试剂盒及应用

本发明涉及基于聚乙烯亚胺(pei)功能化氧化石墨烯(go)和开环聚合(rop)双信号放大策略的高灵敏ctni检测试剂盒及应用，属于生物分析。

背景技术：

1、急性心肌梗死(ami)是造成心血管疾病患者死亡的主要原因，早期诊断对治疗ami的不可逆损伤至关重要。传统的心电图(ecg)不能满足ami的特异性检测。心肌肌钙蛋白i(ctni)因其高度的特异性和敏感性被认为是诊断ami的金标准。一般情况下，正常健康人的ctni值通常在0.3ng/ml以下，ctni值为1.0ng/ml可作为ami的阳性诊断阈值。因此，开发出灵敏度高、特异性强的ctni电化学传感器对于ami的早期诊断、疾病评估和预后具有重要的意义。

2、目前，检测ctni的方法主要有酶联免疫吸附测定法、化学发光免疫分析、荧光免疫分析表面等离子体共振法、比色法、电化学传感法等。其中电化学传感法因其灵敏度高、响应速度快、成本低廉，携带方便、易于微型化和自动化等优点，在ami的早期诊断和预后方面发挥着越来越重要的作用。特别是基于适配体的电化学传感器，由于其对抗体具有特异性高、免疫原性低、体积小、化学稳定性好、电化学单元易于修饰等优点，越来越受到研究人员的青睐。

3、为了提高电化学传感器的分析灵敏度，目前研究者已经开发出许多放大输出信号的策略，如酶催化、纳米材料和聚合物链。聚合反应通过控制聚合物链的动态生长实现信号放大，可有效提高检测灵敏度。其中，开环聚合(rop)是一种高效的活性聚合反应，具有原子经济性和化学特异性的优点，所制备的聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性。二茂铁(fc)及其衍生物因具有良好的化学稳定性、氧化还原性和低毒性常被用作电化学传感器的电活性探针。较为常见的是二茂铁环氧乙烷类的开环聚合，然此rop反应常需在高温无氧条件下进行。但以α-氨基酸-n-羧基酸酐(nca)为单体的rop是一种简单有效的制备多肽聚合物的方法，它可在室温下发生反应，能使电活性聚合物链接枝在生物分子上而不影响蛋白质的结构，有利于电化学生物传感在临床检测方面的广泛应用。因此，可将fc与nca二者结合作为rop反应的单体。

4、氧化石墨烯(go)作为一种优良的新型碳纳米材料，具有比表面积大、分散性好、表面反应活性强等优异性能。go表面含有大量含氧活性基团，便于通过共价键和配位键与其他材料或分子结合组装进行功能修饰。聚乙烯亚胺(pei)是一种含有许多氨基的水溶性聚合物，可通过共价键与环氧基团发生开环反应，因此可制备pei功能化的go(pei-go)作为rop反应的大分子引发剂。

5、综上，本发明目的是研发出以nca-fc作为单体，apt2-go-pei为引发剂，基于pei-go纳米材料和rop聚合反应双重信号放大策略的电化学试剂盒，使其具有灵敏度高、选择性好等特点，可用于ctni的灵敏检测。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于聚乙烯亚胺功能化氧化石墨烯和开环聚合双信号放大的高灵敏ctni检测试剂盒及其使用方法，该试剂盒具有选择性好、灵敏度高等特点。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：

3、基于pei功能化go和rop双信号放大策略的高灵敏ctni检测试剂盒，包括：金电极、apt1、mch、apt2-go-pei生物偶联物、nca-fc、liclo4、超纯水、pbs缓冲液。

4、进一步，apt1的序列为：

5、5’-sh-(ch2)6-cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta-3’。

6、进一步，nca-fc的合成方法为：

7、(1)称取二茂铁甲酸溶于dcm中，0℃条件下滴加三乙胺，再依次加入hbtu和hobt，反应1h后，旋转蒸干，得到产物fc-obt；

8、(2)将tfa在0℃条件下滴入boc-l-lys nca的dcm溶液中，反应1h后，移入室温搅拌过夜，得到nca产物；

9、(3)将三乙胺在0℃条件下滴入所制备的fc-obt中，然后加入所制备的nca，室温反应2天，薄层色谱法监测反应过程，反应结束后进行后处理得到单体nca-fc。

10、其中，

11、步骤(1)和(2)中二茂铁甲酸：三乙胺：hbtu：hobt：boc-l-lys nca的摩尔比例为1：2：1：1：1；

12、步骤(2)中tfa：boc-l-lys nca：dcm的比例关系为0.41ml：1mmol：3ml；

13、步骤(1)和(3)中三乙胺的用量相同；

14、步骤(3)中后处理为依次用饱和nahco3溶液、0.5m盐酸溶液、饱和nahco3溶液和超纯水洗涤，分离dcm有机相，用无水na2so4干燥、过滤，真空干燥。

15、进一步，apt2-go-pei生物偶联物的制备方法为：

16、将4mg go-pei分散在2mlpbs缓冲液中，然后将200μl 10μm apt2溶液加入上述分散液中，在37℃下孵育3h，将产物离心并洗涤，最后用pbs缓冲液重新分散离心产物，以获得均匀的apt2-go-pei生物偶联物；

17、apt2的序列为：5’-cgcatgccaaacgttgcctcatagttccctccccgtgtcc-3’。

18、本发明的技术方案之一是：一种所述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

19、(1)电极修饰

20、①将apt1溶液滴加到金电极上，反应，洗涤，吹干；

21、②将步骤①的电极浸泡在mch溶液中，反应，洗涤，吹干；

22、③将待检测样品滴加至步骤②的电极表面，反应，洗涤，吹干；

23、④将apt2-go-pei生物偶联物溶液滴加到步骤③的电极上，反应，洗涤，吹干；

24、⑤将nca-fc溶液滴加到步骤④的电极表面，反应，洗涤，吹干；

25、(2)电化学检测

26、将修饰后的电极浸入liclo4溶液中，通过方波伏安法记录电流响应，根据电信号大小分析ctni含量。

27、进一步，金电极需进行前处理，前处理方法为：

28、①将金电极分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤；

29、②分别用0.3μm和0.05μm氧化铝粉对金电极表面进行抛光打磨；

30、③依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声洗涤；

31、④用新配制的水虎鱼酸溶液浸泡金电极；

32、⑤重复步骤③；

33、⑥在0.5m h2so4溶液中浸泡电极，电位范围设定为-0.3～1.5v，扫描速率为0.2v/s，重复扫描直至得到重合的循环伏安图；

34、⑦用超纯水洗涤电极，氮气吹干。

35、进一步，步骤①的反应温度为35-40℃，时间为2h；步骤②的反应温度为35-40℃，时间为0.5h；步骤③的孵育温度为35-40℃，时间为1-2h；步骤④的反应温度为35-40℃，时间为1h；步骤⑤的反应温度为室温，时间为1.0-1.5h；步骤(2)中方波伏安法的增加电位：4.0mv，电位幅度：25mv，静止时间：30s。

36、本发明的技术方案之一是：一种所述的检测试剂盒在制备ctni检测试剂中的应用。

37、本发明检测方法的构建过程如图1所示。

38、本发明的有益效果：

39、1、本发明基于pei功能化的go和rop双信号放大策略，构建了一种新型的ctni适配体检测试剂盒。避免了目前常用信号放大策略中生物酶(易受外界环境如ph和温度的影响)的使用，信号得到成倍放大，检测的灵敏度高、效率高、稳定性好。

40、2、二茂铁及其衍生物具有良好的氧化还原特性、稳定性和低毒性，已被广泛用作电化学传感器的电活性探针。本发明合成的单体nca-fc，反应条件温和，室温下即可顺利反应得到。该单体发生rop反应时，操作相对简单，且可直接接枝到电极表面，能够高效地应用于ctni检测中。

41、3、本发明基于pei功能化的go和rop双信号放大策略，成功构建了一种新型电化学适配体检测试剂盒，实现了对ctni的高灵敏检测。apt1探针通过au-s键自组装在金电极表面，通过特异性识别捕获ctni。之后，apt2-go-pei生物偶联物作为rop反应的大分子引发剂，nca-fc作为rop反应的单体，大量的电活性聚合物链通过氨基引发的rop反应接枝到电极表面。pei功能化的go和nca-fc的联合应用不仅保证了反应具有丰富的活性位点，而且大大提高了信号强度，提高了检测的灵敏度。在最佳条件下，该适配体检测试剂盒检测ctni的线性范围宽(10fg/ml～10ng/ml)，检测限低至3.78fg/ml，且研究结果表明本发明试剂盒具有良好的选择性、重现性、稳定性和抗干扰性。同时，本发明在分析真实血清样品时灵敏度高、准确性强，在生物医学检测中具有较大的应用潜力。