一种基于免疫磁珠-适配体禽流感病毒H5N1SERS检测方法

本发明涉及病原微生物检测，具体为一种基于免疫磁珠-适配体禽流感病毒h5n1 sers检测方法。

背景技术：

1、自h5n1亚型禽流感病毒爆发以来，全国乃至全球养殖业深受影响，尤其我国作为禽类养殖大国，h5n1亚型禽流感病毒不仅给禽类养殖造成巨大的经济损失，更为严重的是对人类存在高致病性，它能使禽类的死亡率高达100％，人类则达到60％以上。随着候鸟的迁徙和人类的大规模活动，全球已有六十多个国家发现h5n1亚型禽流感病毒。常用的病毒检测或量化方法可细分为病毒培养、血清学检测、基于核酸的检测方法和基于生物传感器的护理点检测系统。目前，检测h5n1流感病毒的实验室金标准是病毒培养和逆转录聚合酶链式反应。但这些方法却都存在耗时过长、操作复杂、不能达到现场快速诊断的目的，迫切需要一种新型简便、快速、灵敏性较高的病毒检测方法。然而，现有的利用拉曼光谱技术快速检测病毒的方法大多是利用抗原抗体相结合的原理和主成分析技术，检测成本较贵，难以得到全面普及。

2、表面拉曼增强技术(surface enhanced raman spectroscopy,sers)作为一种新兴的分子光谱技术，通过金属纳米结构的局域表面等离激元共振所造成的局部电磁场和拉曼活性指示剂分子来增强目标信号，能够将目标信号放大百万甚至千万(107-1010)，并且可以无视水的影响，检测水样样本。并且因其快速、准确、原位、无损的优点，sers技术已被广泛应用于病毒检测。

3、本实验室长期致力于采用拉曼光谱技术检测病原微生物，目前国内外缺乏有效的h5n1亚型禽流感病毒拉曼光谱快速检测方法。为此，亟待建立一种h5n1亚型禽流感病毒sers快速检测方法。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于免疫磁珠-适配体禽流感病毒h5n1sers检测方法，通过使用链霉亲和素磁珠和h5n1亚型禽流感病毒特异性适配体偶联制备成h5n1亚型禽流感病毒免疫捕获磁珠，免疫捕获磁珠通过捕获h5n1亚型禽流感病毒与另一种h5n1亚型禽流感病毒特异性适配体形成“双适配体夹心”复合物。通过在其表面修饰agnps包被“双适配体夹心”复合物，建立一种基于免疫磁珠-适配体夹心联合表面增强拉曼光谱技术，通过磁性吸附，无需离心分离即可快速、灵敏、高效、原位还原地检测h5n1亚型禽流感病毒的方法，为未来病毒的快速检测带来新的思路。

3、(二)技术方案

4、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于免疫磁珠-适配体禽流感病毒h5n1 sers检测方法，包括以下步骤：

5、s1、h5n1适配体捕获免疫磁珠的制备

6、将apt1适配体(10μl，1.847μg/μl)95℃变性15min，随后迅速放置冰上15min，在静置时，将链霉素亲和磁珠通过旋转20s重悬于原瓶中，取0.2mg链霉素亲和磁珠于离心管中，置于磁力架上静置1min，加入500μlpbs洗涤，重复洗涤3次，取折叠后的apt1适配体室温孵育30min，磁分离后，未结合的游离适配体用pbs溶液洗涤3次，即可制成适配体捕获免疫磁珠。随后加入200μl h5n1病毒，待充分混匀后置于冰箱中4℃孵育1h，每隔20min重悬一次以保证磁珠始终处于悬浮状态，通过磁性分离，将未偶联的病毒洗脱，从而制备h5n1适配体捕获免疫磁珠。

7、s2、免疫磁珠-适配体夹心免疫复合物(imbsis)的制备

8、在h5n1适配体捕获免疫磁珠的基础上，加入20μl折叠后的apt2(20μl，1.847μg/μl)，待充分混匀后置于冰箱中4℃孵育30min，这此期间保证磁珠处于悬浮状态，随后，将h5n1适配体捕获免疫磁珠偶联上折叠后的apt2，即可形成共轭的三明治imbsis，用移液器将imbsis在pbs溶液中进行清洗，并随后进行磁性分离。

9、s3、imbsis@agnps的合成

10、采用shameli k方法通过nabh4作还原剂对agno3还原合成agnps，通过在室温条件下调节二者的比例浓度与孵育时间合成最佳的agnps，取制备好的imbsis，分散到现配制的10mm 50μl agno3溶液中，充分混匀，避光4℃孵育10min，孵育期间令溶液始终处于悬浮状态，之后匀速加入50μl现配制的10mm nabh4溶液，混匀反应1min，立即于1000rpm离心1min，弃掉上清，用50μl无菌去离子水重悬，即可制备成imbsis@agnps。

11、s4、h5n1亚型禽流感病毒sers检测方法的建立

12、检测前使用硅片进行仪器校正，以520.7cm-1处的拉曼峰作为基准峰，拉曼光谱仪参数设置为：拉曼光谱扫描范围为500-2000cm-1，使用532nm的he-ne激光进行激发，激光功率为13.5mw，激光功率密度为0.214mw·um-2，物镜选择50倍，激光衰减参数选择1％，分辨率设置为1cm-1，曝光时间为1min，积分次数为3次，为了提高信噪比，随机检测15到30个点，取10μl待测样品滴至酸液浸泡洗涤并冲洗干净的石英载玻片中央，进行拉曼信号采集，最终数据分析均采用origin software 8.5软件。

13、优选的，筛选所得的h5n1亚型禽流感病毒适配体1序列为gcagaggtccgctgacggatggatggaacaggggtttagcagcaggac cactcttgagcg(apt1)，h5n1亚型禽流感病毒适配体2序列为acctggttactgggtggctacaggggacaccactccgcttcctccggcccgggga gtggc(apt2)。

14、优选的，所述agno3和nabh4最佳浓度均为10mm，最佳孵育时间分别为10min和1min，agnps的sers增强效应最强。

15、(三)有益效果

16、与现有技术相比，本发明提供了一种基于免疫磁珠-适配体禽流感病毒h5n1 sers检测方法，具备以下有益效果：

17、本发明基于链霉素亲和磁珠捕捉系统联合sers技术，建立的sers免疫磁珠原位还原检测禽流感病毒的方法可达到原位、无损、高效、特异性强、灵敏度高、快速、低浓度的检测水平，解决了sers本身特异性的问题，为h5n1亚型禽流感病毒提供了一种新的检测思路，sesr技术作为新兴分析方法不久有望成为一种低成本、高效灵敏且原位检测病原微生物分析的一种的替代法。本发明所建立的方法与传统拉曼检测相比，引入免疫磁珠，具有很强的特异性，重复性良好，有更高的灵敏度，病毒液稀释倍数达109倍，可在1h内完成对h5n1亚型禽流感病毒的快速检测。

技术特征：

1.一种基于免疫磁珠-适配体禽流感病毒h5n1 sers检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于免疫磁珠-适配体禽流感病毒h5n1sers检测方法，其特征在于：筛选所得的h5n1亚型禽流感病毒适配体1序列为gcagaggtccgctgacggatggatggaacaggggtttagcagcaggac cactcttgagcg(apt1)，h5n1亚型禽流感病毒适配体2序列为acctggttactgggtggctacaggggacaccactccgcttcctccggcccgggga gtggc(apt2)。

3.根据权利要求1所述的一种基于免疫磁珠-适配体禽流感病毒h5n1sers检测方法，其特征在于：所述agno3和nabh4最佳浓度均为10mm，最佳孵育时间分别为10min和1min，agnps的sers增强效应最强。

技术总结
本发明公开了一种基于免疫磁珠‑适配体禽流感病毒H5N1SERS检测方法，包括以下步骤：S1、H5N1适配体捕获免疫磁珠的制备将Apt1适配体(10μL，1.847μg/μL)95℃变性15min，随后迅速放置冰上15min，在静置时，将链霉素亲和磁珠通过旋转20s重悬于原瓶中，取0.2mg链霉素亲和磁珠于离心管中，置于磁力架上静置1min，加入500μL PBS洗涤，重复洗涤3次。本发明基于链霉素亲和磁珠捕捉系统联合SERS技术，建立的SERS免疫磁珠原位还原检测禽流感病毒的方法可达到原位、无损、高效、特异性强、灵敏度高、快速、低浓度的检测水平，解决了SERS本身特异性的问题，为H5N1亚型禽流感病毒提供了一种新的检测思路。

技术研发人员：王凯,李乾学,周博
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12