羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒及应用。

背景技术：

1、包虫病(hydatidosis,hydatid disease)，又称棘球蚴病，是细粒棘球绦虫的幼虫感染人体所致的疾病，该病为人畜共患病。狗为终宿主，羊、牛是中间宿主，人因误食虫卵成为中间宿主而患包虫病。细粒棘球蚴囊或称包虫囊是寄生在中间宿主家畜和人体内的发育阶段，囊壁由两层构成，内层直接包裹着囊液，称为生发层。生发层之外的角质层系由生发层分泌形成，为无细胞的较坚韧的板层状结构，囊液透明，内有原头节，育囊和子囊，子囊壁的结构与母襄同。本病广布于世界各地，主要流行于畜牧区。

2、目前包虫病的检测方法有虫卵浓集检查法、槟榔碱法、pcr、酶联免疫吸附分析法等。虫卵浓集检查法通过显微镜观察包虫病虫卵形态来诊断是否感染包虫病，但这种方法费时费力具有高风险，且虫卵形态有差异，不容易区分其物种。槟榔碱法是通过驱除肠壁上的虫体，根据形态学进行鉴定，虽然特异性高，但敏感性不稳定，且操作人员有被感染的风险。pcr技术通过分子工具能准确检测出不同种的包虫病，但需要复杂的仪器设备和专业人员。

3、酶联免疫吸附分析法具有操作简便、检测速度快的优点，因此得到广泛应用。市场上已经有检测包虫病抗体类型的商品化elisa试剂盒，但其包被的抗原过于单一或包被同一组织中多抗原的试剂盒并不能全面检测包虫病不同组织中抗原免疫产生的多种抗体。动物感染包虫病后不同组织中抗原免疫后的抗体产生时间和应答水平均存在差异，这样在检测时很容易漏检或者发生交叉反应，其结果会出现假阴性，准确性不高，难以满足临床检测需求。另外，对于那些已经感染的动物，由于感染个体具有中和抗体使得病毒的复制很慢，导致体内特异性蛋白浓度很低，而商品化的elisa试剂盒敏感性低，使这些低浓度的特异性蛋白很难被检测到，进而会导致部分感染动物的漏检。

技术实现思路

1、有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种抗原5蛋白和生发层抗原蛋白在检测包虫病的应用，所述抗原5蛋白由包括以下任一种核苷酸序列的基因表达得到：

2、seq id no.1所示的核苷酸序列，或，

3、seq id no.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

4、在严格条件下可以与seq id no.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；

5、所述生发层抗原蛋白由包括以下任一种核苷酸序列的基因表达得到：

6、seq id no.2所示的核苷酸序列，或，

7、seq id no.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；或，

8、在严格条件下可以与seq id no.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

9、抗原5存在棘球囊液中，被认为是诊断包虫病的“金标准”；同时包被的生发层抗原有很强的特异性，只存在棘球囊壁中，在棘球囊液中不存在，正好和抗原5形成检测互补关系。只要包虫病感染初期，就能准确检测出包虫病的抗体(抗原5对应的抗体和/或生发层抗原对应的抗体)。

10、在本发明中，所述抗原5蛋白的表达方法优选包括：将包括seq id no.1所示核苷酸序列的基因插入原核载体，得到重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌；

11、在本发明更具体的实施方式中，得到重组菌后，置37℃，200r/min摇床振荡培养至od600nm达到0.6，加入iptg至终浓度为0.8mmol/l，18℃150r/min过夜诱导18h，得到可溶性形式稳定高表达的抗原5蛋白。seq id no.1所示核苷酸序列是优化的大肠杆菌偏爱密码子序列，能在大肠杆菌b l21(de3)中以可溶性形式表达抗原5蛋白，不仅能提高抗原5蛋白的表达量，还能使获得的抗原5蛋白具有高浓度、高纯度、高活性和高稳定性，用此蛋白包被板子检测结果显示灵敏度、特异性均良好。

12、在本发明中，所述生发层抗原蛋白的表达方法优选包括：将包括seq id no.2所示核苷酸序列的基因插入原核载体，得到重组载体；将重组载体转化至大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌；

13、在本发明更具体的实施方式中，得到重组菌后，置37℃，200r/min摇床振荡培养至od600nm达到0.6，加入iptg至终浓度为0.6mmol/l，18℃180r/min过夜诱导表达16h，得到可溶性形式稳定高表达的生发层抗原蛋白。seq id no.2所示核苷酸序列是优化的大肠杆菌偏爱密码子序列，能在大肠杆菌b l21(de3)中以可溶性形式表达生发层抗原蛋白，不仅能提高生发层抗原蛋白的表达量，还能使获得的生发层抗原蛋白具有高浓度、高纯度、高活性和高稳定性，用此蛋白包被板子检测结果显示灵敏度、特异性均良好。

14、鉴于抗原5和生发层抗原联用的检测互补特性，本发明提供了所述抗原5蛋白和生发层抗原蛋白在制备检测包虫病抗体的产品中的应用。

15、进一步的，本发明还提供了一种羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，包括包被抗原，所述包被抗原包括所述抗原5蛋白和生发层抗原蛋白。

16、优选的，所述试剂盒还包括化学发光抗原包被板、酶标二抗、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、发光底物和洗涤液中的一种或者多种。本发明利用所述包被抗原，基于化学发光免疫分析方法制备的微孔板式试剂盒能更准确、更敏感性、更高效的进行检测，对预防和控制包虫病的发生和流行具有重要意义。

17、优选的，本发明所述酶标二抗优选为辣根过氧化物酶标记的二抗。在本发明优选的具体实施方式中，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊igg抗体。

18、优选的，本发明所述样品稀释液以磷酸盐缓冲液为基础，添加酪蛋白和tween-20；以磷酸盐缓冲液的体积为100vol％计，所述酪蛋白的添加量优选为0.4-0.6vol％，更优选为0.5vol％；所述tween-20的添加量优选为0.4-0.6vol％，更优选为0.5vol％。

19、优选的，本发明所述发光底物包括发光底物a和发光底物b；所述发光底物a以ph值为7.5-8.5、浓度为0.04-0.06mol/l的tris缓冲液为基础溶剂，添加0.08-0.12mmol/l的鲁米诺和0.8-1.2g/l的羟基香豆素；所述发光底物b以ph值为5.0-5.5、浓度为0.04-0.06mol/l的醋酸铵溶液为基础溶剂，添加0.06-0.08mmol/l的维生素c和2.7-3.3mmol/l的氨基酸氧化酶。更优选的，所述发光底物a以ph值为8.0、浓度为0.05mol/l的tris缓冲液为基础溶剂，添加0.1mmol/l的鲁米诺和1g/l的羟基香豆素；所述发光底物b以ph值为5.2、浓度为0.05mol/l的醋酸铵溶液为基础溶剂，添加0.07mmol/l的维生素c和3mmol/l的氨基酸氧化酶。

20、优选的，所述洗涤液以10倍浓缩计，包括0.018-0.022mol/l的磷酸二氢钠、0.07-0.09mol/l的磷酸氢二钠、1.29-1.45mol/l的氯化钠和0.4-0.6vol％的tween-20；更优选的，所述洗涤液以10倍浓缩计，包括0.02mol/l的磷酸二氢钠、0.08mol/l的磷酸氢二钠、1.37mol/l的氯化钠和0.5vol％的tween-20。

21、所述洗涤液以10倍浓缩计，ph值优选为7.3-7.5；更优选为7.4。

22、在本发明中，所述稀释液在使用时，优选使用无菌水将浓缩液稀释为正常浓度后进行使用。

23、优选的，所述化学发光抗原包被板的包被液以ph值为9.2-9.8的碳酸盐缓冲液为基础溶剂，添加0.9-1.1μg/ml的抗原5蛋白和0.9-1.1μg/ml的生发层抗原蛋白。更优选的，所述化学发光抗原包被板的包被液以ph值为9.6的碳酸盐缓冲液为基础溶剂，添加1μg/ml的抗原5蛋白和1μg/ml的生发层抗原蛋白。1μg/ml的抗原包被浓度在后续光学检测中的光指数和信噪比表现上具有最佳效果。

24、本发明还提供了所述试剂盒在非疾病诊断目的的细粒棘球绦虫检测中的应用，所述应用包括如下任意一种：

25、(1)检测饮食产品中是否含有细粒棘球绦虫；

26、(2)检测畜牧养殖环境中是否含有细粒棘球绦虫；

27、(3)检测水源中是否含有细粒棘球绦虫。

28、优选的，所述应用包括如下步骤：

29、s1、样品经样品稀释液稀释后，加入化学发光抗原包被板中，反应10-20min；

30、s2、洗涤液洗涤步骤s1所述反应后的化学发光抗原包被板，加入酶标二抗，孵育10-20min；

31、s3、洗涤液洗涤步骤s2所述孵育后的化学发光抗原包被板，加入发光底物，15-25℃反应4-8min；用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值；

32、s4、根据步骤s3得到的发光值，判断检测样品中是否含有包虫病抗体；

33、步骤s1所述稀释的倍数优选为100倍稀释。100倍稀释的样品在后续光学检测中的光指数和信噪比表现上具有最佳效果。

34、步骤s1所述反应的温度优选为36-38℃，更优选为37℃；反应时间优选为15-20min，更优选为15min。

35、步骤s2所述孵育的温度优选为36-38℃，更优选为37℃；孵育时间优选为15-20min，更优选为15min。

36、步骤s3所述反应的时间优选为5-6min，更优选为5min。

37、步骤s4所述判断的方法包括：

38、根据公式计算s/p值，s/p值＝(检测样品发光值-阴性对照血清样品发光值)/(阳性对照血清样品发光值-阴性对照血清样品发光值)；

39、若s/p值＜0.35，判定样品为包虫病抗体阴性；若s/p值≥0.35，判定样品为包虫病抗体阳性。

40、有益效果：

41、本发明提供了一种羊包虫病抗体微孔板式化学发光检测试剂盒，其中，包被抗原包括抗原5蛋白和生发层抗原蛋白；所述抗原5蛋白由包括seq id no.1所示核苷酸序列的基因表达得到；所述生发层抗原蛋白由包括seq id no.2所示核苷酸序列的基因表达得到。其中，所述抗原5蛋白存在棘球囊液中；而所述生发层抗原有很强的特异性，只存在棘球囊壁中，在棘球囊液中不存在，正好和抗原5形成检测互补关系，只要包虫病感染初期，就能准确检测出抗体。本发明提供的试剂盒可适用于包虫病感染后的早期或中后期的抗体检测。同时，本发明seq id no.1和seq id no.2所示核苷酸序列的基因可以使包被抗原以可溶性形式表达，并能提高包被抗原的表达量、活性和稳定性，提高试剂盒的检测灵敏度。经实验验证，本发明提供的试剂盒可以准确的检测羊包虫病感染初期产生的抗原5蛋白和生发层抗原蛋白抗体，判断被检动物是否感染包虫病，其敏感性、特异性、稳定性和重复性好，尤其适用于低浓度样本的检测以及疫病的早期诊断，对包虫病的防控和畜牧业的发展有着重大意义。