用于改进单克隆抗体的蛋白质测序的电子转移解离和质谱的制作方法

本发明的各方面总体上涉及用于表征抗体序列保真度的方法。更具体地，本公开提供了分析物理化学技术、蛋白质片段选择标准和多变量分析，以使用电子转移解离(etd)和质谱(ms)实现更高的序列准确性和覆盖率。

背景技术：

1、单克隆抗体(mab)疗法由于其高特异性和优选的药代动力学特性，有望继续成为生物制药市场的主要力量(walsh,2018,《自然生物技术(nat biotechnol)》,36:1136-1145；kaplon等人,2020,《mabs》,12:1703531；mould和meibohm,2016,《生物制药(biodrugs)》,30:275-293)。由于糖基化和二硫键对单克隆抗体(mab)的正常功能的重要性，mab通常在哺乳动物细胞系统中产生。

2、然而，除了应用mab功能所需的修饰外，已知哺乳动物细胞系统中的生产还会引入产物异质性(meibohm等人,2019,《制药生物技术基础与应用(pharmaceuticalbiotechnology fundamentals and applications)》,第5版)。由于翻译后修饰(ptm)微异质性会影响mab疗法的重要质量属性，包含稳定性、溶解度以及药效学和药代动力学特性，因此监管机构需要广泛的分析表征，以确保产品质量和一致性(meibohm等人)。

3、质谱(ms)技术，特别是自上而下和自下而上的质谱(ms)，已被证明是抗体的结构表征的有力工具。每种方法都提供有关蛋白质结构和潜在翻译后修饰的独特信息(fornelli等人,2018,《分析化学(anal chem)》,90:8421-8429；wang等人,2019,《科学报告(sci rep)》,9:2345)。质谱可以与液相色谱结合使用，例如液相色谱-质谱(lc-ms)或液相色谱-串联质谱(lc-ms2或lc-ms/ms)，以进一步增强表征分析物(例如，抗体)的能力。

4、自上而下的ms将完整质量分析与串联质谱(ms2)相结合，不需要酶促消化，并提供了丰富的信息，例如翻译后修饰，蛋白质结构和药物-靶标相互作用(donnelly等人,2019,《自然方法(nat methods)》,16:587-594)。然而，抗体等大型生物制药的自上而下的ms2具有局限性。其中最主要的是大分子的惊人大小，限制了在没有任何酶处理的情况下可能的序列覆盖率(fornelli等人)。

5、自下而上ms是一种替代性方法，其可以提供具有氨基酸水平分辨率的序列覆盖率。此技术的一个缺点是高序列覆盖率是以大量样品制备为代价的，包含例如蛋白质变性、二硫还原、半胱氨酸烷基化和/或目标蛋白质的酶促消化(nielsen等人,2008,《自然方法》,5:459-460；lippincott等人,1999,《分析生物化学anal biochem)》,267:57-64)。自下而上ms不仅劳动密集型，而且在样品制备期间也会引入化学修饰伪影。由于存在这种风险，自下而上ms需要大量开发才能产生一种优化的方法，以最大限度地减少样品制备引起的伪影。

6、自中而下ms是一种用于抗体表征的替代性方法，其结合了自上而下和自下而上ms分析的优点(chait,2006,《科学(science)》,314:65-66；fornelli等人,2014,《分析化学》,86:3005-3012；tsybin等人,2011,《分析化学》,83:8919-8927；fornelli等人,2012,《分子与细胞蛋白组学(mol cell proteomics)》,11:1758-1767)。自中而下ms分析通常使用化脓性链球菌(ides)的免疫球蛋白g降解酶将单克隆抗体(mab)切割成其亚基。mab亚基的自中而下ms分析可以与电子转移解离(etd)偶联，因为蛋白酶消化有限的大亚基具有大于+3的电荷，这对于etd片段分析是优选的。这些高电荷气相前体离子用etd碎片化以产生c和z离子系列，其揭示了有关所关注蛋白质的结构信息，例如氨基酸序列和ptm身份(mikesh等人,2006,《生物化学与生物物理学学报(biochim biophys acta)》,《蛋白质蛋白质组学(proteins proteomics)》,1764:1811-1822；syka等人,2004,《美国国家科学院院刊(pnas)》,101:9528-9533；zhurov等人,2013,《化学学会评论(chem soc rev)》,42:5014-5030)。

7、由于etd对前体离子的碎片化利用离子-离子相互作用期间的低能电子，并通过放热过程诱导骨架切割，因此不稳定的ptm保存在ms2谱中，允许它们鉴定和定位到特定的氨基酸(brodbelt,2016,《分析化学》,88:30-51)。完整单克隆抗体的电子转移解离碎片化首先由tsybin等人报道，而单克隆抗体亚基的etd碎片化首先由fornelli等人提出。

8、先前使用etd进行自中而下分析的工作证明，每次反相液相色谱质谱(rplc-ms)运行fc/2亚基的序列覆盖率可以达到49％，并且通过组合至少六个etd运行，将覆盖率增加到68％(fornelli等人2014)。最近，显示出通过以下方式覆盖率进一步提高到87％：将三次etd运行(59.8％)，一次电子转移高能碰撞解离(ethcd)运行(51.7％)和两次紫外光解离(uvpd)运行(61.2％)整合到分析中，结合多种碎片化技术(fornelli等人2018；fornelli等人2014)。

9、由于目前市场上的质谱仪是为广泛的应用而设计的，因此需要广泛的仪器参数优化才能找到特定应用的最优参数。未满足的需求是一种确定最优参数的方法，以最大化mab亚基的etd ms2序列覆盖率。

10、质谱仪和碎片化方法(包含混合碎片化方法和uvpd)的进步成比例地增加了分析人员应考虑的仪器参数数量。有许多不同的方法和参数来增加抗体亚基的序列覆盖率，找到一组最优条件可能是一项重大挑战。对于etd，许多可用参数之间的相互作用以及它们如何影响电荷减少、碎片化效率和ms2谱图质量经常被忽视，通常用于分析的设置通常基于既定理论、先前的经验或已发表的方法。最近的质谱仪，如orbitrap fusion lumos tribrid，包含复杂的etd校准程序，但它们是使用相对较小的分析物(如血管紧张素)进行的，不能代表在大蛋白质的自上而下或自中而下分析过程中碎片化的较大离子。此外，这些例程并未考虑可能影响etd片段生产的所有仪器漂移源和其对最优参数的影响。

11、因此，需要一种系统的方法来优化仪器etd操作条件，以提供最大的ms2序列覆盖率，并且可以应用于所有质谱仪。

12、因此，期望提供一种简单的方法，用于对蛋白质，具体地抗体和抗体亚基进行准确和精确的测序。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的是采用统计实验设计(doe)方法，所述方法可以用于确定最优电子转移解离(etd)参数，以最大化单克隆抗体亚基的序列覆盖率。另外，所述方法可以应用于一系列治疗性单克隆抗体，以确定分子特异性参数，因为在电子转移解离(etd)实验期间，每种抗体的片段可能略有不同。

2、具体地，本发明提供了可用于对蛋白质进行准确的从头测序的方法，如使用etd和ms的抗体或抗体亚基，例如lc-ms2。doe通知这些方法，使得鉴定和选择d型最优仪器设置。

3、找到最优etd ms2参数的一种方法是利用实验设计(doe)，它允许筛选不同的参数组合，以找到提供亚基的最大序列覆盖率的参数。doe允许同时评估仪器的许多不同参数，而不是“一次评估一个因素”(ofat)，考虑到ms仪器参数的数量，这是低效的。

4、具体地，m/z(质荷比)隔离窗口、etd反应时间、etd试剂靶标和ms2 agc靶标(具有自动增益控制的串联质谱)是影响etd ms2谱图质量的重要参数，因此会影响整体ms2亚基序列覆盖率。

5、为了减少工作量并仍然具有有意义的模型，采用了d型优化设计。d型最优设计是一种计算机辅助设计，其中选择所有可能组合的子集，目的是最大化doe的d型效率(deaguiar等人,1995,《化学计量学和智能实验室系统(chemom intell lab syst)》,30:199-210)。d型最优设计可以应用于etd，以推断控制etd ms2序列覆盖率的相关参数(使用用户选择的影响所选结果的参数组为基础)，估计每个参数和相互作用的效应大小，预测这些选择的参数组合产生的响应，并最终确定改进的操作条件以实现最大覆盖率(randall等人,2013,《美国质谱学会会志(j am soc mass spectrom)》,24:1501-1512；kelstrup等人,2012,《蛋白质组研究杂志(j proteom res)》,11:3487-3497；sun等人,2013,《质谱分析中的快速通信(rapid commun mass spectrom)》,27:157-162；coffey和yang,2018,《生物技术过程发展统计(statistics for biotechnology process development)》)。

6、因此，doe是一种强大的数学工具，可以使用本发明的方法应用以提高多肽的序列覆盖率，例如mab或mab亚基，具体地当应用于etd ms2分析时。

7、本发明还提供了已根据本发明的方法测序的蛋白质，例如抗体、变体或抗体融合。

8、本发明的优点包含但不限于，使用分析物理化学对蛋白质(例如，治疗性抗体)进行高速和准确的从头测序的稳健且高度准确的测定；作为制造序列的一部分，由于上述原因，产生了具有更高序列置信度的治疗性抗体；广泛应用于完善临床开发和商业用途中的抗体生产；单克隆抗体亚基的序列覆盖率高于任何已发表的etd方法；更高的序列覆盖率，ptm信息完好无损，没有样品伪影，即保留不稳定的ptm；更高的序列覆盖率(sc)，例如，比已知方法提高了19-26％，并有可能达到100％ sc；步骤最少，易于使用，成本更低。

9、本公开提供了一种用于改进多肽的序列覆盖率的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括(a)针对串联质谱选择影响序列覆盖率的至少两个参数；以及(b)使用d型最优实验设计来确定所述至少两个参数中的每个参数的值，其中所述值是基于最大化序列覆盖率来选择的。

10、一方面，所述多肽是抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段、抗体亚基、宿主细胞蛋白、蛋白质药物产品或其消化片段。

11、一方面，所述方法进一步包括针对多肽的两个或更多个亚基依次或并行执行所述方法。在具体方面，所述亚基选自包含以下的组：抗体的fc/2、fd或lc亚基。

12、一方面，所述串联质谱是自中而下质谱。

13、一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于轨道阱的质谱仪。

14、一方面，所述串联质谱包含电子转移解离、碰撞诱导解离、电子转移/碰撞诱导解离、电子转移/高能碰撞解离、紫外线光解离或其组合。另一方面，所述串联质谱包含自动增益控制。

15、一方面，所述质谱仪耦接到液相色谱系统。在具体方面，所述液相色谱系统包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、混合模式色谱或其组合。

16、一方面，所述至少两个参数选自包含以下的组：m/z隔离窗口、etd反应时间、etd试剂靶标、ms2 agc靶标以及其任何组合。

17、本公开还提供了一种用于确定多肽的氨基酸序列的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括(a)使用d型最优实验设计确定多肽的用于串联质谱的至少两个参数的值，其中所述值是基于最大化序列覆盖率来选择的；以及(b)使用所述至少两个参数的所述值使所述多肽经受串联质谱分析，以确定所述多肽的氨基酸序列。

18、一方面，所述多肽是抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段、抗体亚基、宿主细胞蛋白、蛋白质药物产品或其消化片段。

19、一方面，所述方法进一步包括针对多肽的两个或更多个亚基依次或并行执行所述方法。在具体方面，所述亚基选自包含以下的组：抗体的fc/2、fd或lc亚基。

20、一方面，所述串联质谱是自中而下质谱。

21、一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于轨道阱的质谱仪。另一方面，所述串联质谱包含电子转移解离、碰撞诱导解离、电子转移/碰撞诱导解离、电子转移/高能碰撞解离、紫外线光解离或其组合。在另一方面，所述串联质谱包含自动增益控制。

22、一方面，所述质谱仪耦接到液相色谱系统。在具体方面，所述液相色谱系统包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、混合模式色谱或其组合。

23、一方面，所述至少两个参数选自包含以下的组：m/z隔离窗口、etd反应时间、etd试剂靶标、ms2 agc靶标以及其任何组合。

24、一方面，所述方法进一步包括在串联质谱分析之前使所述多肽经受酶促消化。在具体方面，所述酶促消化包括使所述多肽与ides接触。另一方面，所述方法进一步包括在串联质谱分析之前使所述多肽经受还原。

25、一方面，所述方法进一步包括独立地执行所述方法两次或更多次，并且将从每次串联质谱分析中鉴定出的片段组合，以确定所述多肽的氨基酸序列。

26、本公开提供了另外一种用于改进多肽的序列覆盖率的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括(a)针对串联质谱选择至少两个参数，所述至少两个参数影响每次选择不同片段大小的片段数量；以及(b)使用d型最优实验设计来确定所述至少两个参数中的每个参数的值，其中所述值是基于针对所述选定的片段大小中的每个片段大小产生最大数量的片段来选择的。

27、一方面，所述多肽是抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段、抗体亚基、宿主细胞蛋白、蛋白质药物产品或其消化片段。

28、一方面，所述方法进一步包括针对多肽的两个或更多个亚基依次或并行执行所述方法。在具体方面，所述亚基选自包含以下的组：抗体的fc/2、fd或lc亚基。

29、一方面，所述串联质谱是自中而下质谱。

30、一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于轨道阱的质谱仪。

31、一方面，所述串联质谱包含电子转移解离、碰撞诱导解离、电子转移/碰撞诱导解离、电子转移/高能碰撞解离、紫外线光解离或其组合。另一方面，所述串联质谱包含自动增益控制。

32、一方面，所述质谱仪耦接到液相色谱系统。在具体方面，所述液相色谱系统包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、混合模式色谱或其组合。

33、一方面，所述至少两个参数选自包含以下的组：m/z隔离窗口、etd反应时间、etd试剂靶标、ms2 agc靶标以及其任何组合。

34、一方面，所述片段大小选自包含以下的组：低于约5,000da的片段、介于约5,000da与约10,000da之间的片段以及大于约10,000da的片段。

35、本公开进一步提供了另一种用于确定多肽的氨基酸序列的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括(a)使用d型最优实验设计确定多肽的用于串联质谱的至少两个参数的值，其中所述值是基于针对每次选择的不同片段大小产生最大数量的片段来选择的；(b)使用每个选定片段大小的所述至少两个参数的所述值使所述多肽经受串联质谱分析；以及(c)使用每个选定片段大小的所述至少两个参数的所述值，将从所述串联质谱分析中鉴定出的片段组合，以确定所述多肽的氨基酸序列。

36、一方面，所述多肽是抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段、抗体亚基、宿主细胞蛋白、蛋白质药物产品或其消化片段。

37、一方面，所述方法进一步包括针对多肽的两个或更多个亚基依次或并行执行所述方法。在具体方面，所述亚基选自包含以下的组：抗体的fc/2、fd或lc亚基。

38、一方面，所述串联质谱是自中而下质谱。

39、一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于轨道阱的质谱仪。另一方面，所述串联质谱包含电子转移解离、碰撞诱导解离、电子转移/碰撞诱导解离、电子转移/高能碰撞解离、紫外线光解离或其组合。在另一方面，所述串联质谱包含自动增益控制。

40、一方面，所述质谱仪耦接到液相色谱系统。在具体方面，所述液相色谱系统包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、混合模式色谱或其组合。

41、一方面，所述至少两个参数选自包含以下的组：m/z隔离窗口、etd反应时间、etd试剂靶标、ms2 agc靶标以及其任何组合。

42、一方面，所述方法进一步包括在串联质谱分析之前使所述多肽经受酶促消化。在具体方面，所述酶促消化包括使所述多肽与ides接触。另一方面，所述方法进一步包括在串联质谱分析之前使所述多肽经受还原。

43、一方面，所述方法进一步包括独立地执行所述方法两次或更多次，并且将从每次串联质谱分析中鉴定出的片段组合，以确定所述多肽的氨基酸序列。

44、本公开提供了另一种用于确定抗体的氨基酸序列的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括(a)针对etd-ms2选择影响抗体的每个亚基的序列覆盖率的至少两个参数，其中所述亚基包含fd、fc/2和lc；(b)使用d型最优实验设计来确定所述亚基中的每个亚基的所述至少两个参数中的每个参数的值，其中所述值是基于最大化所述亚基的序列覆盖率来选择的；(c)使所述抗体与ides和还原剂接触以产生所述亚基；(d)使用所述至少两个参数的所述值使所述亚基中的每个亚基经受etd-ms2分析，以鉴定所述亚基中的每个亚基的片段的氨基酸序列；(e)独立地重复步骤(d)至少一次以上，以鉴定所述亚基中的每个亚基的另外片段的氨基酸序列；以及(f)将(d)和(e)的所述片段的所述氨基酸序列组合，以确定所述抗体的氨基酸序列。

45、本公开提供了另一种用于确定抗体的氨基酸序列的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括(a)针对etd-ms2选择影响抗体的每个亚基的小片段、中等片段和大片段数量的至少两个参数，其中所述亚基包含fd、fc/2和lc，所述小片段由小于约5,000da的片段组成，所述中等片段由约5,000da至约10,000da的片段组成，并且所述大片段由大于10,000da的片段组成；(b)使用d型最优实验设计来确定所述亚基中的每个亚基的所述片段大小中的每个片段大小的所述至少两个参数中的每个参数的值，其中所述值是基于产生所述亚基的所述大小的最大数量的片段来选择的；(c)使所述抗体与ides和还原剂接触以产生所述亚基；(d)使用所述片段大小中的每个片段大小的所述至少两个参数的所述值使所述亚基中的每个亚基经受etd-ms2分析，以鉴定所述亚基中的每个亚基的片段的氨基酸序列；(e)独立地重复步骤(d)至少一次以上，以鉴定所述亚基中的每个亚基的另外片段的氨基酸序列；以及(f)将(d)和(e)的所述片段的所述氨基酸序列组合，以确定所述抗体的氨基酸序列。

46、当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。