确定生物分子身份的方法与流程

本发明涉及一种用于确定生物分子身份的改进方法，特别是区分生物分子的变体，例如病毒血清型等。这种方法具有简化生物制造、疾病诊断、环境问题监测和污染物测定的测试的潜势。

背景技术：

1、生物药物或生物制剂可以被描述为含有由生物过程制成或源自生物来源的复杂活性物质的治疗剂。“生物制剂”是一个广泛的术语，包括广泛的产品，例如细胞、组织、血液衍生产品、核酸、重组蛋白、抗体、疫苗、基因治疗病毒、激素和酶。生物药物通常通过注射或输注给药，并且已经可用于治疗许多疾病。

2、许多生物制剂的生产包括通常使用遗传操作方法来使用活细胞，例如人细胞、动物细胞或微生物。例如，单克隆抗体可以在中国仓鼠卵巢细胞(cho)中产生。

3、生物制剂测试是生产过程中的一个关键过程，因为这些复杂的分子可能会因它们的生产过程的变化而改变；它们可能对能够导致聚集和降解的因素敏感，从而影响生物活性、产品安全性和质量。制造过程中的意外或无法解释的改变会导致不同的产品属性(即漂移)。因此，确定产品的确切性质至关重要。

4、必须持续监控质量、安全性和功效，以满足严格的法规要求。例如，在生产中确定污染物的存在、身份和浓度是一项法规要求。

5、在生物制剂生产中，由于生产的细胞、细胞的代谢状态以及在生物反应器中或下游纯化中的其他工艺条件的异质性增加，产品的确切性质以及污染物的身份和相对浓度可能会随着时间的推移而改变。这种漂移是一种分析挑战，因为大量可能的变化(寡聚化和蛋白质组装、翻译后修饰、纯化效率的变化或加工步骤的失败)可能导致最终产品组合物中非常不同的变化，这只能通过结合探测产品质量的各个方面的多种分析技术来分析。这导致漫长而昂贵的释放测试程序(ramanan et al.biodrugs 28,pages 363-372(2014))。随着生物仿制药进入市场，这一点尤为重要；这些生物仿制药是与另一种已获批准的生物药物(“参比药物”)高度相似的生物制剂。因此，具有不同质量体系的多家制造商可能会生产类似的生物制剂。产品漂移的不同模式可能导致生物制剂之间有临床意义的差异。

6、一类生物制剂是单克隆抗体(mabs)，它已经成为最强大的可用的治疗和诊断工具之一。分子生物学、免疫学的最新进展和强大的生产平台的开发将推动更多适用于治疗其他疾病和病症的抗体的开发。预计这将引起更大的工业设施的发展，以增加产量，满足日益增长的需求。该领域的人员意识到抗体特有的关键质量控制属性，以及需要进行的扩大规模考虑。(gaughan,c.l.,molecular diversity volume 20,pages 255-270(2016))。

7、目前，漂移和释放或成品测试可以涉及许多测试方案，包括但不限于：外观、渗透压、ph值、基于细胞的生物测定、内毒素测试、各种色谱技术：尺寸排阻色谱；反相色谱法；离子交换色谱、氨基酸分析、蛋白质浓度测定、肽图分析、聚糖谱图、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦和宿主细胞测定，包括糖、维生素、代谢物、蛋白质(通常为elisa)和dna测定。

8、有一种为生物制剂提供更多实时释放测试的趋势。实时释放测试(rtrt)被定义为“基于过程数据评估和确保过程中和/或最终药品质量的能力，通常包括测量的材料属性和过程控制的有效组合”(jiang et al.，biotech&bioeng 2017，https://doi.org/10.1002/bit.26383)。然而，尽管rtrt可以提供潜在的改进，制造商正在考虑实施这种方法的实用性，因此，尚未完全受益于其承诺。存在许多问题，包括使用哪种仪器以及在生产过程中何时何地进行分析。

9、干涉光散射显微术的一种特定方法是质量光度法，它采用特定的空间滤波器来实现更高的灵敏度。质量光度法为测量样品中生物分子的质量和相对浓度提供了一种有效的方法。这项技术通过捕捉每个分子在界面上散射的光来测量单个生物分子的质量。散射对比度的提取提供了质量的间接测量。质量光度法建立在干涉反射显微术和干涉散射显微术的原理之上。通过仔细控制照明、检测光束路径中的新型空间滤波策略和仔细的图像分析，已经证明可以可靠地检测单个分子散射的微小量的光，更重要的是，它与分子质量直接相关(young etal.，science 2018，360(6387)，423-7)。然而，目前质量光度法和干涉光散射技术通常不能区分分子质量非常相似的粒子。例如，粒子可能具有非常相似的质量，因为它们是相同生物分子的变体。这种变体可能是不同糖基化的蛋白质。有时，分辨率不足以区分各个物种。因此，目前的干涉光散射显微术的方法，特别是质量光度法不能单独地加快诸如释放测试等技术，因为需要额外的测试。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的是提供一种区分质量相似的生物分子的方法。质量相似的生物分子可能彼此相关，即相同生物分子的亚型。质量相似的生物分子可以是相同生物分子的变体。本发明的另外一个目的是提供一种改进的方法来确定样品中生物分子的身份，例如能够区分可能的变体，例如亚型、糖型、重组质粒、物种、血清型或突变体。这种确定将使得能够进行诸如释放测试的技术，其中已知样品包含生物分子。因此，该方法可用于确定具有一定质量的分子的特定特性。在释放测试中，生物分子的预测质量可以是已知的，因此可以确定具有适当质量的分子的其他特性。

2、生物分子在包括疾病发展在内的生物过程中起着不可或缺的作用，因此生物分子的准确检测和/或鉴定对于疾病诊断和治疗至关重要。此外，考虑到生物环境和工业样品等也可以含有质量相似的粒子，识别样品中生物分子的方法可以有其他的应用。

3、生物分子无疑是复杂的。细胞中产生的生物分子根据细胞的细胞途径来进行处理。即使在自然环境中，不同的处理也会导致亚型的产生。当与生物分子的原始细胞相比时，宿主细胞可以使用不同的途径进行加工。这可能导致差异处理，例如，蛋白质折叠的变化、核酸甲基化的变化、糖基化模式的变化、表面电荷的变化等。因此，生物分子的物理特性可以通过在不同的细胞类型中处理而改变。根据所用的单体单元，生物分子可分为四大类，蛋白质、碳水化合物、脂类和核酸。这些单体单元不同，且包括不同的化学基团，它们可以具有不同的属性，例如氨基酸(肽和蛋白质的组成部分)可以是极性的、非极性的、带正电荷或负电荷的。生物分子可以由多于一种的单体组成，例如糖基化蛋白质、糖基化rna、脂蛋白、脂质修饰的寡核苷酸和糖脂。通常，生物分子在某种程度上是折叠的，将一些单体放在核心，而将其他单体暴露在表面。因此，生物分子在它们的表面具有许多化学基团，所有这些都有助于确定生物分子的物理特性。产生生物分子的方式的改变可能会改变表面化学，导致特性的改变，特别是表面的特性。类似地，如果分子改变了构象，先前的内部部分形成了外表面的一部分，这些也将具有特定的特性。

4、任何生物分子，无论是蛋白质、碳水化合物或核酸，都可以根据某些物理特性的差异与其他分子区分开来。物理特性包括但不限于定义为长度或质量的尺寸、电荷、结合亲和力(例如形成弱的非共价键，即氢键、离子键和范德华引力；加上有利的疏水相互作用的能力)和疏水性。因此，生物分子可以由例如它们的分子量(质量)和它们的等电点(pi)来定义。生物分子的等电点或等离子点是生物分子不携带净电荷并因此被认为是中性的ph值。生物分子的pi主要取决于任何可电离基团的解离常数(kd)。精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、组氨酸、谷氨酸、赖氨酸和谷氨酸都是蛋白质中典型的电离基团，它们在决定蛋白质的pi中起主要作用。然而，共翻译和翻译后修饰(包括磷酸化、甲基化、烷基化)在决定生物分子的pi中具有重要作用。所有生物分子，包括但不限于病毒、核酸、多糖和脂质，都有等电点。

5、本发明依赖于生物分子与表面的相互作用。生物分子如何与表面相互作用是由该生物分子的性质或特性决定的。这可以通过选择合适的表面来确定特定的性质或特性，改变或不改变生物分子与表面接触的一个或多个条件，例如温度来利用。生物分子和表面的相互作用可以使用干涉光散射显微术来确定。这种技术检测(interrogate)表面和样品的界面，并检测与表面相互作用的生物分子。可以通过重复测量来跟踪每个生物分子，给出生物分子和表面相互作用的图像。这允许测定生物分子在表面上的迁移率。

6、表面和生物分子之间的相互作用可以是由于任何类型的相互作用，从疏水性到共价键的形成。表面和生物分子之间的相互作用可以是由于离子/静电相互作用。这些相互作用是由于生物分子的物理特性。

7、因此，本发明提供了一种确定样品中生物分子身份的方法，包括确定生物分子与表面的相互作用。

8、提供有：

9、一种使用干涉光散射装置识别样品中生物分子的方法；所述方法包括：

10、(i)使所述样品与第一表面接触，并对所述第一表面上的所述生物分子进行多次测量，并使用所述测量来确定所述生物分子在所述表面上的迁移率；

11、(ii)使用第二表面重复步骤(i)并确定所述生物分子在所述表面上的迁移率；

12、(iii)使用在步骤(i)和步骤(ii)中确定的生物分子的迁移率来构建所述生物分子的谱图；

13、(iv)将在步骤(iii)中获得的谱图与至少一个参考谱图进行比较以识别生物分子。

14、因此，本发明的方法包括可以以任何适当顺序执行的几个步骤。

15、可以选择表面，使得表面化学允许确定生物分子的至少一个物理特性。可以选择表面以确定生物分子与表面的相互作用，最显著的是生物分子在表面上的迁移率。

16、使表面与样品接触，样品可以含有生物分子。可以选择表面与样品接触的一个或多个条件，以允许确定生物分子的至少一个物理特性。可以选择表面以确定生物分子与表面的相互作用，最显著的是生物分子在表面上的迁移率。

17、通过创建或制作谱图，样品中生物分子的身份可以通过测量生物分子在表面上的迁移率来测量，该谱图包括从至少第一表面和第二表面获得的数据(例如步骤(i)和(ii))。

18、第一表面和第二表面可以是不同的表面。

19、第一表面和第二表面可以是相同的表面。在这种情况下，第二表面在至少一个改变的条件(当与第一表面相比时)下与样品接触。改变的条件可以选自以下各项中任意一种：温度；ph值；离子强度、氧化还原电位、施加在表面和溶液之间的电位以及试剂的存在。试剂可以是改变生物分子和表面相互作用的任何试剂，例如以下各项中任意一种或多种：去污剂、离液剂(chaotropic agent)、还原剂、缓冲剂、离子、盐、溶剂、变性剂和/或交联剂。可以根据需要改变多个条件。

20、当在表面检测到生物分子之后，可以在生物分子与表面保持接触的同时对其进行重复测量。这使得能够在生物分子移动穿过表面时酌情对其进行跟踪。这些重复的测量被描述为进行“多次测量”，也可以被描述为随时间进行的测量或在一段时间内进行的测量。可以根据生物分子的预期迁移率适当地选择进行这些测量的频率。频率可以在10hz到10khz的范围内，可选地50hz到5khz，优选地100hz到1khz。可以在这些范围内或从这些范围中选择任何合适的频率。因此，随时间对生物分子进行多次测量，以监测分子在表面上的迁移率。

21、对生物分子与表面的相互作用进行多次测量允许跟踪该生物分子。检测和/或跟踪可以在单个生物分子的水平上进行。

22、可以使用任何测量来确定生物分子的质量，可选地，可以使用在步骤(i)或步骤(ii)中进行的测量，或者可以进行独立的测量来确定质量。

23、可以通过获取已知的生物分子并用至少第一表面和第二表面进行该方法来制作参考谱图。该参考谱图可以是从每个表面获得的单个组合谱图或一组谱图。生物分子与表面的相互作用(例如迁移率)的汇总可用于构建谱图。谱图可以被定义为识别或被认为识别特定生物标记物的一组特性。谱图可以是数据的汇总或分析，以任何适当的形式，例如坐标图或表格，这些数据表示独特的特性。

24、根据本发明的另一个方面，提供了一种识别样品中生物分子的方法，所述方法包括使所述样品与第一表面接触，并使用干涉散射装置随时间对所述生物分子进行多次测量，以及使用所述多次测量来确定所述生物分子在第一表面上的质量和迁移率，以确定所述生物分子的至少一个物理特性。

25、以下特征可应用于本发明的任何方面：

26、可以选择第一表面，使得表面化学允许确定生物分子的至少一个物理特性。

27、第一表面与样品接触，样品可以含有生物分子。可以选择第一表面与样品接触的一个或多个条件，以允许确定生物分子的至少一个物理特性。

28、样品中生物分子的身份可以通过确定在第一表面上生物分子的质量和迁移率来确定，而不需要进一步的测量。或者，可能需要进一步的测量，例如在更复杂的样品中，或者在生物分子的潜在变体具有相似特性的情况下。

29、进一步的测量可以包括：

30、使所述样品与第二表面接触，并使用干涉散射装置随时间对所述生物分子进行多次测量，以及使用所述多次测量来确定所述生物分子在第二表面上的质量和迁移率，以确定所述生物分子的至少一个物理特性。

31、替代地或附加地，进一步的测量可以包括：

32、使所述样品与第一表面接触，并改变所述样品的一个或多个条件，以确定所述生物分子的至少一个物理特性。所述条件可以定义为影响生物分子与表面结合从而影响表面和生物分子的反应的条件。

33、可以改变的样品的条件包括但不限于：温度、ph、离子强度、化学物质的存在，例如去污剂、离液剂、还原剂、氧化剂、氧化还原试剂、缓冲剂、离子、溶剂、变性剂和/或交联剂。

34、如果需要进一步的测量，用不同表面和/或改变的条件获得的测量可以与用第一表面获得的测量相结合或进行比较，以提供足够的信息来识别生物分子。这可以导致确定生物分子的质量和两个或更多的物理特性。

35、由于可以在一个或多个表面上或在一个或多个条件下进行多次测量，可以确定与生物分子一致的谱图。该谱图可以单独地足以确定生物分子的身份，或者该谱图可以与先前获得的已知生物分子的参考谱图进行比较。

36、根据一个方面，本方法提供了一种识别样品中生物分子的方法，所述方法包括：

37、使所述样品与第一表面接触，并使用干涉散射装置随时间对所述生物分子进行多次测量，以及使用所述多次测量来确定所述生物分子在第一表面上的质量和迁移率，以及使用所述质量和迁移率来定义所述生物分子的谱图，该谱图可以与参考谱图相比较。

38、可以使用第二表面和/或第二组条件重复该方法，以补充谱图。可以使用另一个表面和/或另一组条件重复该方法，以补充谱图。

39、根据一个方面，本方法提供了一种识别样品中生物分子的方法，所述方法包括：

40、使所述样品与第一表面接触，使用干涉散射装置随时间对所述生物分子进行多次测量，以及使用所述多次测量来确定所述生物分子在第一表面上的质量和迁移率，

41、使所述样品与第二表面接触，使用干涉散射装置随时间对所述生物分子进行多次测量，以及使用所述多次测量来确定所述生物分子在第二表面上的质量和迁移率，

42、以及组合或比较第一表面和第二表面上的测量以确定生物分子的身份。

43、根据一个方面，本方法提供了一种识别样品中生物分子的方法，所述方法包括：

44、使所述样品与第一表面在第一组条件下接触，使用干涉散射装置随时间对所述生物分子进行多次测量，以及使用所述多次测量来确定所述生物分子在第一表面上第一条件下的质量和迁移率，

45、使所述样品与第一表面在第二组条件下接触，使用干涉散射装置随时间对所述生物分子进行多次测量，以及使用所述多次测量来确定所述生物分子在第一表面上第二条件下的质量和迁移率，

46、以及组合或比较第一条件和第二条件下的测量以确定生物分子的身份。

47、以下特征可应用于本发明的任何方面：

48、随时间的多次测量可用于确定每个生物分子与表面相互作用的时间和/或生物分子在表面上的移动。这些测量可以被认为是生物分子在表面上的“迁移率”。因此，迁移率可以定义为在表面上行进的距离和/或生物分子与表面相互作用的时间长度。可以测量其中一个或两个。可以测量生物分子在表面上行进的距离，它可以被描述为穿过表面的横向或水平移动。替代地或附加地，可以测量生物分子与表面相互作用的时间。这种相互作用时间表示来自表面的移动，使得生物分子不再与表面相互作用，而是移动或扩散到样品溶液中。这种形式的迁移取决于生物分子与表面相互作用的强度。表面和生物分子之间的相互作用可以指示生物分子的特性，从而提供关于生物分子的信息。